परिधीय लेंस संरचना, सेल आकृति विज्ञान और संगठन की कल्पना और मात्रा निर्धारित करने के लिए पूरे माउंट इमेजिंग
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल छवि मात्रा का ठहराव के तरीकों के साथ ओकुलर लेंस में परिधीय संरचनाओं के दृश्य के लिए उपन्यास पूरे माउंट इमेजिंग का वर्णन करते हैं। इन प्रोटोकॉल का उपयोग लेंस माइक्रोस्केल संरचनाओं और लेंस विकास / फ़ंक्शन के बीच संबंधों को बेहतर ढंग से समझने के लिए अध्ययन में किया जा सकता है।
Abstract
ओकुलर लेंस एक पारदर्शी लचीला ऊतक है जो रेटिना पर विभिन्न दूरी से प्रकाश को केंद्रित करने के लिए अपने आकार को बदल देता है। अंग के चारों ओर एक तहखाने झिल्ली के अलावा, जिसे कैप्सूल कहा जाता है, लेंस पूरी तरह से सेलुलर होता है जिसमें पूर्वकाल गोलार्ध पर उपकला कोशिकाओं का एक मोनोलेयर और लेंस फाइबर कोशिकाओं का एक बड़ा द्रव्यमान होता है। पूरे जीवन में, उपकला कोशिकाएं लेंस भूमध्य रेखा पर अंकुरण क्षेत्र में फैलती हैं, और भूमध्यरेखीय उपकला कोशिकाएं नवगठित फाइबर कोशिकाओं में माइग्रेट करती हैं, लम्बी होती हैं और अंतर करती हैं। भूमध्यरेखीय उपकला कोशिकाएं काफी हद तक आकृति विज्ञान को बेतरतीब ढंग से पैक किए गए कोबल-पत्थर के आकार की कोशिकाओं में संरेखित षट्भुज के आकार की कोशिकाओं में बदल देती हैं, जिससे मेरिडियल पंक्तियाँ बनती हैं। नवगठित लेंस फाइबर कोशिकाएं हेक्सागोनल सेल आकार को बनाए रखती हैं और पूर्वकाल और पीछे के ध्रुवों की ओर बढ़ती हैं, जिससे कोशिकाओं का एक नया खोल बनता है जो फाइबर की पिछली पीढ़ियों पर मढ़ा जाता है। उन तंत्रों के बारे में बहुत कम जानकारी है जो लेंस उपकला कोशिकाओं के उल्लेखनीय आकारिकी को फाइबर कोशिकाओं तक ले जाते हैं। लेंस संरचना, विकास और कार्य को बेहतर ढंग से समझने के लिए, ओकुलर लेंस के पूरे माउंट का उपयोग करके परिधीय संरचनाओं की छवि के लिए नए इमेजिंग प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं। यहां, कैप्सूल मोटाई, उपकला सेल क्षेत्र, सेल परमाणु क्षेत्र और आकार, मेरिडियल पंक्ति सेल ऑर्डर और पैकिंग, और फाइबर सेल चौड़ाई की मात्रा निर्धारित करने के तरीके दिखाए जाते हैं। ये माप आजीवन लेंस विकास के दौरान होने वाले सेलुलर परिवर्तनों को स्पष्ट करने और उम्र या विकृति के साथ होने वाले परिवर्तनों को समझने के लिए आवश्यक हैं।
Introduction
ओकुलर लेंस आंख के पूर्वकाल क्षेत्र में स्थित एक लचीला, पारदर्शी ऊतक है जो रेटिना पर प्रकाश को ठीक करने का कार्य करता है। लेंस के कार्य करने की क्षमता को इसकी जटिल वास्तुकला और संगठन 1,2,3,4,5,6 के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। लेंस ऊतक के आसपास कैप्सूल है, लेंस संरचना और बायोमैकेनिकल गुणों 7,8,9 को बनाए रखने के लिए आवश्यक एक तहखाने झिल्ली. लेंस स्वयं पूरी तरह से सेलुलर है, जिसमें दो सेल प्रकार शामिल हैं: उपकला और फाइबर कोशिकाएं। उपकला परत cuboidal कोशिकाओं है कि लेंस10 के पूर्वकाल गोलार्द्ध को कवर की एक monolayer के होते हैं. जीवन भर, उपकला कोशिकाएं लेंस कैप्सूल के साथ लेंस भूमध्य रेखा की ओर बढ़ती हैं और पलायन करती हैं। पूर्वकाल उपकला कोशिकाओं पार अनुभाग में मौन और कोबल-पत्थर हैं, और लेंस भूमध्य रेखा के पास, उपकला कोशिकाओं प्रसार और नए फाइबर कोशिकाओं11,12 में भेदभाव प्रक्रिया से गुजरना शुरू. भूमध्यरेखीय उपकला कोशिकाएं बेतरतीब ढंग से पैक की गई कोशिकाओं से हेक्सागोन के आकार की कोशिकाओं के साथ संगठित मध्याह्न पंक्तियों में बदल जाती हैं। हेक्सागोनल सेल आकार इन विभेदक कोशिकाओं के बेसल पक्ष पर बनाए रखा जाता है, जबकि शिखर पक्ष लेंस फुलक्रम या मोडिओलस 4,13,14,15 पर संकुचित और लंगर डालता है। जैसे ही भूमध्यरेखीय उपकला कोशिकाएं नवगठित फाइबर कोशिकाओं में बढ़ने लगती हैं, कोशिकाओं की शिखर युक्तियां पूर्वकाल उपकला कोशिकाओं की शिखर सतह के साथ पूर्वकाल ध्रुव की ओर पलायन करती हैं, जबकि बेसल युक्तियां लेंस कैप्सूल के साथ पीछे के ध्रुव की ओर बढ़ती हैं। फाइबर कोशिकाओं की नई पीढ़ी कोशिकाओं की पिछली पीढ़ियों को ओवरले करती है, जिससे फाइबर के गोलाकार गोले बनते हैं। सेल बढ़ाव और परिपक्वता प्रक्रिया के दौरान, फाइबर कोशिकाओं काफी हद तक उनके आकारिकी 11,12,16 में परिवर्तन. ये फाइबर कोशिकाएं लेंस द्रव्यमान 11,12,16,17,18 का बड़ा हिस्सा बनाती हैं।
आणविक तंत्र जो जटिल लेंस माइक्रोस्ट्रक्चर, सेल आकृति विज्ञान और अद्वितीय सेलुलर संगठन स्थापित करने में योगदान करते हैं, पूरी तरह से ज्ञात नहीं हैं। इसके अलावा, समग्र लेंस फ़ंक्शन (पारदर्शिता, लेंस आकार परिवर्तन) में लेंस कैप्सूल और सेल संरचना का योगदान स्पष्ट नहीं है। हालांकि, इन संबंधों को नई इमेजिंग पद्धति और लेंस संरचनात्मक और सेलुलर विशेषताओं 2,4,19,20,21,22 के मात्रात्मक आकलन का उपयोग करके स्पष्ट किया जा रहा है। पूरे लेंस की छवि के लिए नए प्रोटोकॉल जो लेंस कैप्सूल, उपकला कोशिकाओं और परिधीय फाइबर कोशिकाओं के उच्च स्थानिक रिज़ॉल्यूशन विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देते हैं, विकसित किए गए हैं। इसमें कैप्सूल मोटाई, सेल आकार, सेल नाभिक आकार और परिपत्रता, मेरिडियल पंक्ति क्रम, फाइबर सेल पैकिंग और फाइबर सेल चौड़ाई की मात्रा निर्धारित करने के लिए कार्यप्रणाली शामिल है। ये दृश्य और छवि परिमाणीकरण विधियां गहराई से मॉर्फोमेट्रिक परीक्षा की अनुमति देती हैं और समग्र 3 डी ऊतक संरचना को संरक्षित करके अन्य विज़ुअलाइज़ेशन विधियों (फ्लैट माउंट या ऊतक वर्गों की इमेजिंग) पर फायदे हैं। इन विधियों ने उपन्यास परिकल्पनाओं के परीक्षण के लिए अनुमति दी है और लेंस सेल पैटर्न विकास और कार्य की समझ में निरंतर प्रगति को सक्षम करेगा।
निम्नलिखित प्रयोगों के लिए, हम जंगली प्रकार और Rosa26-tdTomato चूहों अग्रानुक्रम डिमर-टमाटर (B6.129(Cg)-Gt(ROSA) (tdTomato)23 (जैक्सन लेबोरेटरीज) का उपयोग C57BL/6J पृष्ठभूमि में 6 और 10 सप्ताह की उम्र के बीच, दोनों लिंगों के। tdTomato चूहों tdTomato प्रोटीन की अभिव्यक्ति के माध्यम से जीवित लेंस में सेलुलर प्लाज्मा झिल्ली के दृश्य के लिए अनुमति देते हैं जो एन-टर्मिनल myristylation और आंतरिक सिस्टीन-palmitoylation साइटों23 के माध्यम से प्लाज्मा झिल्ली को लक्षित करता है कि एक उत्परिवर्तित MARCKS प्रोटीन के एन-टर्मिनल 8 एमिनो एसिड से जुड़े हुए हैं। हम मूल रूप से डॉ. रॉबर्ट एडेलस्टीन (नेशनल हार्ट, फेफड़े और ब्लड इंस्टीट्यूट, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ, बेथेस्डा, एमडी) से प्राप्त NMIIAE1841K/E1841K चूहों24 का भी उपयोग करते हैं। जैसा कि पहलेवर्णित है 20, NMIIAE1841K/E1841K FvBN/129SvEv/C57Bl6 पृष्ठभूमि में चूहों में CP49 मनके मध्यवर्ती फिलामेंट प्रोटीन का नुकसान होता है (परिपक्व फाइबर सेल आकृति विज्ञान और पूरे लेंस बायोमैकेनिक्स को बनाए रखता है), C57BL6/J जंगली प्रकार के चूहों के साथ बैकक्रॉस किया जाता है। हमने जंगली प्रकार के CP49 एलील की उपस्थिति के लिए संतानों की जांच की।
कन्फोकल इमेजिंग एक 20x (एनए = 0.8, काम दूरी = 0.55 मिमी, 1x ज़ूम), एक 40x (एनए = 1.3 तेल उद्देश्य, काम दूरी = 0.2 मिमी, 1x ज़ूम), या एक 63x (एनए = 1.4 तेल उद्देश्य, काम दूरी = 0.19 मिमी, 1x ज़ूम) बढ़ाई के साथ एक लेजर-स्कैनिंग कन्फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर प्रदर्शन किया गया था। सभी छवियों को एक पिनहोल आकार का उपयोग करके प्राप्त किया गया था, जो ऑप्टिकल सेक्शन मोटाई का एक निर्धारक है, 1 हवादार इकाई (परिणामी ऑप्टिकल मोटाई आंकड़ा किंवदंतियों में बताई गई है)। छवियों को ज़ेन सॉफ्टवेयर पर संसाधित किया गया था। छवियों को .tif प्रारूप में निर्यात किया गया था और फिर फिजी इमेजजे सॉफ्टवेयर (imageJ.net) में आयात किया गया था।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्णित प्रोटोकॉल लेंस के पूर्वकाल और भूमध्यरेखीय क्षेत्रों में परिधीय लेंस संरचनाओं और कोशिकाओं के उच्च स्थानिक संकल्प दृश्य को सक्षम करते हैं। इस अध्ययन में, बरकरार (लाइव या निश्चित) लेंस का उपयोग क?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को नेशनल आई इंस्टीट्यूट ग्रांट R01 EY032056 से CC और R01 EY017724 से VMF के साथ-साथ नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज द्वारा अनुदान संख्या P20GM139760 के तहत समर्थित किया गया था। एसटीआई को एनआईएच-एनआईजीएमएस टी 32-GM133395 द्वारा रसायन विज्ञान-जीवविज्ञान इंटरफ़ेस प्रीडॉक्टोरल प्रशिक्षण कार्यक्रम के हिस्से के रूप में और डेलावेयर ग्रेजुएट स्कॉलर्स अवार्ड विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 3 mm Biopsy Punch | Acuderm Inc | NC9084780 | |
| Agarose | Apex BioResearch Products | 20-102GP | |
| Antimycotic/Antibiotic | Cytiva | SV30079.01 | |
| Bovine Serum Albumin (Fraction V) | Prometheus | 25-529 | |
| Delicate task wipes | Kimwipe | ||
| Glass bottomed dish (Fluorodish) | World Precision International | FD35-100 | |
| Hoescht 33342 | Biotium | 40046 | |
| Laser scanning confocal Microscope 880 | Zeiss | ||
| MatTek Imaging Dish | MatTek Life Sciences | P35G-1.5-14 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 100503-917 | |
| PBS | GenClone | 25-507B | |
| Phenol red-free medium 199 | Gibco | 11043023 | |
| Rhodamine-Phalloidin | Thermo Fisher | 00027 | |
| Triton X100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| WGA-640 | Biotium | CF 640R |
Riferimenti
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