Verwendung von Ex-vivo-Live-Bildgebung zur Untersuchung von Zellteilungen und -bewegungen während der Zahnerneuerung von Mäusen
Summary
Die Ex-vivo-Live-Bildgebung ist eine leistungsfähige Technik zur Untersuchung der dynamischen Prozesse zellulärer Bewegungen und Interaktionen in lebendem Gewebe. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Zwei-Photonen-Mikroskopie implementiert, um dentale Epithelzellen in kultivierten ganzen erwachsenen Mausschneidezähnen live zu verfolgen.
Abstract
Der kontinuierlich wachsende Maus-Schneidezahn entwickelt sich zu einem sehr handhabbaren Modellsystem, um die Regulation adulter epithelialer und mesenchymaler Stammzellen und die Zahnregeneration zu untersuchen. Diese Vorläuferpopulationen teilen, bewegen und differenzieren sich aktiv, um die Gewebehomöostase aufrechtzuerhalten und verlorene Zellen regenerieren. Herkömmliche Analysen mit fixierten Gewebeschnitten konnten jedoch die dynamischen Prozesse zellulärer Bewegungen und Interaktionen nicht erfassen, was unsere Fähigkeit, ihre Regulationsmechanismen zu untersuchen, einschränkte. In dieser Arbeit wird ein Protokoll beschrieben, um ganze Mausschneidezähne in einem Explantatkultursystem zu erhalten und dentale Epithelzellen mit Hilfe von Multiphotonen-Zeitraffermikroskopie live zu verfolgen. Diese Technik ergänzt unseren bestehenden Werkzeugkasten für die zahnmedizinische Forschung und ermöglicht es Forschern, raumzeitliche Informationen über das Verhalten und die Organisation von Zellen in einem lebenden Gewebe zu gewinnen. Wir gehen davon aus, dass diese Methodik den Forschern helfen wird, die Mechanismen weiter zu erforschen, die die dynamischen zellulären Prozesse steuern, die sowohl während der Zahnerneuerung als auch der Zahnregeneration stattfinden.
Introduction
In den letzten zwei Jahrzehnten hat sich der Schneidezahn der Maus zu einer unschätzbaren Plattform für die Erforschung der Prinzipien der Regulation adulter Stammzellen und der Zahnregeneration entwickelt 1,2. Der Schneidezahn der Maus wächst kontinuierlich und erneuert sich während des gesamten Lebens des Tieres. Dies geschieht durch die Erhaltung sowohl epithelialer als auch mesenchymaler Stammzellen, die sich selbst erneuern und in verschiedene Zelltypen des Zahns differenzieren können 1,2. Während aus dentalen Epithelstammzellen Ameloblasten entstehen, die die Schmelzmatrix absondern, entstehen aus dentalen mesenchymalen Stammzellen Odontoblasten, Zementoblasten und Fibroblasten, die Dentin, Zement bzw. Parodontalband bilden 3,4,5,6. Diese konstante Zufuhr neuer Zellen hält die Gewebehomöostase aufrecht und ermöglicht den Ersatz alter Zellen, die durch Kauverschleiß oder Verletzungen verloren gehen 7,8. Die Aufklärung der zellulären und molekularen Mechanismen, die den Erhalt und die Differenzierung von dentalen Stammzellen regulieren, ist daher von zentraler Bedeutung für das Verständnis der Zahnregeneration, einem Bereich von wachsendem Interesse.
Anatomisch gesehen ist ein großer Teil des Schneidezahns der erwachsenen Maus vom Kieferknochen umhüllt. Während die Schneidekante des Zahns freiliegt, passt das apikale Ende des Schneidezahns in eine Alveole und ist über parodontale Bänder und Bindegewebe fest mit dem umgebenden Knochen verbunden (Abbildung 1A,B). Das apikale Ende des Schneidezahns ist auch die Wachstumsregion des Zahns und erhält Zahnstamm- und Vorläuferzellen sowohl in der Epithelschicht als auch in der mesenchymalen Pulpa 9,10,11,12,13. Insbesondere werden dentale Epithelstammzellen am knolligen Ende des Epithels gehalten, der sogenannten apikalen Knospe, die auch als labiale zervikale Schleife bezeichnet wird (Abbildung 1C). Ähnlich wie im Darmepithel und in der Epidermis wird die Epithelerneuerung im Schneidezahn in erster Linie durch aktiv zyklische Stammzellen und ihre hochproliferativen Zwischennachkommen, die sogenannten transitverstärkenden Zellen 14,15,16,17, unterstützt, die sich beide im inneren Teil der Zervixschlinge befinden. Ob das Schneideepithel während der Regeneration ruhende Stammzellen enthält und verwertet, muss jedoch noch geklärt werden. Im Gegensatz dazu wurden sowohl aktive als auch ruhende mesenchymale Stammzellen in der apikalen Pulpa identifiziert, und die ruhenden Stammzellen fungieren als Reservepopulation, die während der Verletzungsreparatur aktiviert wird13,18.
Viele der Entdeckungen über die Biologie der Erneuerung und Regeneration der Schneidezähne von Mäusen sind das Ergebnis histologischer Untersuchungen, bei denen Proben an bestimmten zeitlichen Punkten entnommen, fixiert, verarbeitet und dann entlang einer bestimmten Ebene in mikrometerdünne Scheiben geschnitten werden. Durch die detaillierte Analyse histologischer Schnitte aus verschiedenen Mausmodellen, die eine Rückverfolgung der Abstammungslinie oder genetische Störungen ermöglichen, haben die Wissenschaftler die Zelllinien verschiedener Vorläuferpopulationen sowie die genetischen und Signalwege identifiziert, die die Homöostase der Schneidezähne und die Reparatur von Verletzungen steuern 19,20,21. Die statischen zweidimensionalen (2D) Bilder von nicht-vitalen Zellen in Schnitten können jedoch nicht das gesamte Spektrum zellulärer Verhaltensweisen und räumlicher Organisationen in lebendem Gewebe erfassen, wie z. B. Zellformveränderungen, Bewegungen und zelluläre Kinetik. Das Erkennen und Messen dieser schnellen zellulären Veränderungen, die in einer Zeitskala auftreten, die durch Gewebeschnitte nicht aufgelöst werden kann, erfordert eine andere Strategie. Darüber hinaus ist die Erfassung solcher Informationen auch entscheidend, um zu verstehen, wie Zahnzellen miteinander interagieren, auf verschiedene Signalreize reagieren und sich selbst organisieren, um Gewebestrukturen und -funktionen aufrechtzuerhalten.
Das Aufkommen der vierdimensionalen (4D) Tiefengewebebildgebung mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie22, einer Technologie, die drei räumliche Dimensionen mit zeitlicher Auflösung integriert, überwindet die inhärenten Einschränkungen der histologischen Analyse, indem sie eine raumzeitliche Untersuchung von kultivierten Gewebeexplantaten, Organoiden oder sogar Geweben in situ ermöglicht 23,24,25,26 . Zum Beispiel hat die 4D-Live-Bildgebung des sich entwickelnden Zahnepithels die raumzeitlichen Muster von Zellteilungen und -migrationen enthüllt, die das Gewebewachstum, die Bildung von Signalzentren und die Morphogenese des dentalen Epithels koordinieren 27,28,29,30,31,32. Im Schneidezahn der erwachsenen Maus wurde die 4D-Bildgebung kürzlich angepasst, um das zelluläre Verhalten während der Reparatur von Zahnepithelverletzungen zu untersuchen. Live-Bildgebung zeigte, dass Stratum-Intermedium-Zellen in der suprabasalen Schicht direkt in Ameloblasten in der Basalschicht umgewandelt werden können, um das geschädigte Epithel zu regenerieren, was das traditionelle Paradigma der Reparatur von Epithelverletzungen in Frage stellt15.
Hier beschreiben wir die Dissektion, Kultivierung und Bildgebung des adulten Mausschneidezahns, wobei wir uns auf Epithelzellen in der labialen Zervixschleife konzentrieren (Abbildung 1). Diese Technik bewahrt die Vitalität der Zahnzellen für mehr als 12 Stunden und ermöglicht das Live-Tracking von fluoreszenzmarkierten Zellen mit Einzelzellauflösung. Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung von Zellbewegungen und -migrationen sowie dynamische Veränderungen der Zellform und Teilungsorientierung unter normalen Kulturbedingungen oder in Reaktionen auf genetische, physikalische und chemische Störungen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Bildgebung von Live-Gewebe ist eine wichtige Technik, die es uns ermöglicht, die dynamischen Prozesse und Verhaltensweisen von Zellen zu untersuchen, wenn sie in ihrer Nischenumgebung gehalten werden41. Im Idealfall wird die Live-Bildgebung in vivo mit hoher raumzeitlicher Auflösung durchgeführt. Die In-vivo-Bildgebung von Säugetierorganen kann jedoch aufgrund der Unzugänglichkeit des Gewebes, der optischen Undurchsichtigkeit und der Schwierigkeit, das Tier oder das Orga…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken dem UCLA Advanced Light Microscopy/Spectroscopy Laboratory und dem Leica Microsystems Center of Excellence am California NanoSystems Institute (RRID:SCR_022789) für die Bereitstellung von Zwei-Photonen-Mikroskopie. AS wurde durch ISF 604-21 der Israel Science Foundation unterstützt. JH wurde von R03DE030205 und R01DE030471 des NIH/NIDCR unterstützt. AS und JH wurden auch durch Zuschüsse 2021007 der United States-Israel Binational Science Foundation (BSF) unterstützt.
Materials
| 24 well, flat bottom tissue culture plate | Olympus plastics | 25-107 | |
| 25x HC IRAPO motCORR water dipping objective | Leica | 11507704 | |
| Ascorbic acid (Vitamin C) | Acros Organics | 352685000 | |
| D-(+)-Glucose bioxtra | Sigma Aldrich | G7528 | |
| Delta T system | Bioptechs | 0420-4 | Including temperature control, culture dishes, and perfusion setup |
| Dissection microscope- LEICA S9E | Leica | LED300 SLI | |
| DMEM/F12 | Thermo Scientific | 11039047 | Basal media without phenol red |
| Feather surgical blade (#15) | Feather | 72044-15 | |
| Fine forceps | F.S.T | 11252-23 | |
| Glutamax | Thermo Scientific | 35050-061 | Glutamine substitute |
| Leica SP8-DIVE equipped with a 25X HC IRAPO motCORR water dipping objective | Leica | n/a | |
| low-melting agarose | NuSieve | 50080 | |
| non-essential amino acids (100x) | Thermo Scientific | 11140-050 | |
| penicillin–streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Petri dish | Gen Clone | 32-107G | 90 mm |
| Rat serum | Valley Biomedical | AS3061SC | Processed for live imaging |
| Razor blade #9 | VWR | 55411-050 | |
| Scalpel handle | F.S.T | 10003-12 | |
| Scissors | F.S.T | 37133 | |
| serrated forceps | F.S.T | 11000-13 | |
| spring scissors | F.S.T | 91500-09 |
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