Использование изображений ex vivo в реальном времени для исследования деления и движения клеток во время обновления зубов мыши
Summary
Визуализация ex vivo в реальном времени является мощным методом изучения динамических процессов клеточных движений и взаимодействий в живых тканях. Здесь мы представляем протокол, который реализует двухфотонную микроскопию для отслеживания эпителиальных клеток зубов в культивируемых цельных резцах взрослой мыши.
Abstract
Непрерывно растущий резец мыши становится модельной системой с высокой проходимостью для исследования регуляции взрослых эпителиальных и мезенхимальных стволовых клеток и регенерации зубов. Эти популяции-предшественники активно делятся, перемещаются и дифференцируются, поддерживая гомеостаз тканей и оперативно регенерируя утраченные клетки. Однако традиционные анализы с использованием фиксированных срезов тканей не могли охватить динамические процессы клеточных движений и взаимодействий, что ограничивало наши возможности по изучению их регуляции. В данной статье описывается протокол сохранения целых резцов мыши в системе культивирования эксплантов и отслеживания эпителиальных клеток зубов в реальном времени с помощью многофотонной таймлапс-микроскопии. Этот метод дополняет наш существующий инструментарий для стоматологических исследований и позволяет исследователям получать пространственно-временную информацию о поведении и организации клеток в живой ткани. Мы ожидаем, что эта методология поможет исследователям в дальнейшем изучении механизмов, контролирующих динамические клеточные процессы, происходящие как во время обновления зубов, так и во время регенерации.
Introduction
За последние два десятилетия резцы мыши стали бесценной платформой для исследования принципов регуляции взрослых стволовых клеток и регенерации зубов 1,2. Резец мыши постоянно растет и обновляется на протяжении всей жизни животного. Это достигается за счет поддержания как эпителиальных, так и мезенхимальных стволовых клеток, которые могут самообновляться и дифференцироваться в различные типы клеток зуба 1,2. В то время как зубные эпителиальные стволовые клетки дают начало амелобластам, которые секретируют эмалевый матрикс, зубные мезенхимальные стволовые клетки дают начало одонтобластам, цементобластам и фибробластам, которые образуют дентин, цемент и периодонтальную связку соответственно 3,4,5,6. Это постоянное поступление новых клеток поддерживает гомеостаз тканей и позволяет заменять старые клетки, которые теряются из-за жевательного износа или травм 7,8. Таким образом, выяснение клеточных и молекулярных механизмов, регулирующих поддержание и дифференцировку стоматологических стволовых клеток, занимает центральное место в понимании регенерации зубов, области, представляющей растущий интерес.
Анатомически большая часть резцов взрослой мыши заключена в челюстную кость. В то время как режущий край зуба обнажен, апикальный конец резца входит в лунку и прочно прикрепляется к окружающей кости через периодонтальные связки и соединительные ткани (рис. 1A, B). Апикальный конец резца также является областью роста зуба и поддерживает стволовые и прогениторные клетки зуба как в эпителиальном слое, так и в мезенхимальной пульпе 9,10,11,12,13. В частности, стволовые клетки зубного эпителия поддерживаются на луковичном конце эпителия, известном как апикальная почка, также называемая губной шейной петлей (рис. 1C). Подобно эпителию кишечника и эпидермису, обновление эпителия в резце в основном поддерживается активно циркулирующими стволовыми клетками и их высокопролиферативными промежуточными потомками, называемыми транзитно-амплифицирующими клетками14, 15, 16, 17, расположенными во внутренней части шейной петли. Тем не менее, содержит ли эпителий резца и использует ли он покоящиеся стволовые клетки во время регенерации, еще предстоит определить. Напротив, в апикальной пульпе были идентифицированы как активные, так и неподвижные зубные мезенхимальные стволовые клетки, а неподвижные стволовые клетки функционируют как резервная популяция, которая активируется во время восстановления травмы13,18.
Многие из открытий в области биологии обновления и регенерации резцов мышей являются результатом гистологических исследований, в ходе которых образцы получают в различных временных точках, фиксируют, обрабатывают, а затем разрезают на микронные тонкие срезы вдоль определенной плоскости. Благодаря детальному анализу гистологических срезов различных мышиных моделей, которые позволяют отслеживать родословную или генетические возмущения, ученые определили клеточные линии различных популяций предшественников, а также генетические и сигнальные пути, которые контролируют гомеостаз резцов и восстановление повреждений 19,20,21. Однако статические двумерные (2D) изображения невитальных клеток в разрезах не могут охватить весь спектр клеточного поведения и пространственных организаций в живой ткани, таких как изменения формы клеток, движения и клеточная кинетика. Обнаружение и измерение этих быстрых клеточных изменений, которые происходят в масштабе времени, неразрешимом с помощью срезов тканей, требуют другой стратегии. Более того, получение такой информации также имеет решающее значение для понимания того, как зубные клетки взаимодействуют друг с другом, реагируют на различные сигнальные стимулы и самоорганизуются для поддержания тканевых структур и функций.
Появление четырехмерной (4D) визуализации глубоких тканей с использованием двухфотонной микроскопии22, технологии, которая объединяет три пространственных измерения с временным разрешением, преодолевает ограничения, присущие гистологическому анализу, позволяя проводить пространственно-временное исследование культивируемых тканевых эксплантов, органоидов или даже тканей in situ 23,24,25,26 . Например, 4D-визуализация развивающегося эпителия зуба в реальном времени выявила пространственно-временные закономерности деления и миграции клеток, которые координируют рост тканей, формирование сигнального центра и морфогенез зубного эпителия 27,28,29,30,31,32. В резце взрослой мыши 4D-визуализация недавно была адаптирована для изучения клеточного поведения во время восстановления повреждений зубного эпителия. Визуализация в реальном времени показала, что промежуточные клетки слоя в надбазальном слое могут быть непосредственно преобразованы в амелобласты в базальном слое для регенерации поврежденного эпителия, что бросает вызов традиционной парадигме восстановления повреждений эпителия15.
Здесь мы опишем вскрытие, культивирование и визуализацию резца взрослой мыши, уделяя особое внимание эпителиальным клеткам в губной шейной петле (рис. 1). Этот метод сохраняет жизнеспособность зубных клеток в течение более 12 часов и позволяет отслеживать флуоресцентно меченные клетки в реальном времени с разрешением одной клетки. Этот подход позволяет исследовать движение и миграцию клеток, а также динамические изменения формы клеток и ориентации деления в нормальных условиях культивирования или в ответ на генетические, физические и химические возмущения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Визуализация живых тканей является важным методом, который позволяет нам изучать динамические процессы и поведение клеток, когда они сохраняются в своей нишевойсреде. В идеале визуализация в реальном времени выполняется in vivo с высоким пространственно-временным разр…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Выражаем признательность Лаборатории передовой световой микроскопии/спектроскопии Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе и Центру передового опыта Leica Microsystems при Калифорнийском институте наносистем (RRID:SCR_022789) за предоставление двухфотонной микроскопии. AS был поддержан ISF 604-21 Израильским научным фондом. JH поддержали R03DE030205 и R01DE030471 из NIH/NIDCR. AS и JH также получили грант 2021007 от Американо-израильского двунационального научного фонда (BSF).
Materials
| 24 well, flat bottom tissue culture plate | Olympus plastics | 25-107 | |
| 25x HC IRAPO motCORR water dipping objective | Leica | 11507704 | |
| Ascorbic acid (Vitamin C) | Acros Organics | 352685000 | |
| D-(+)-Glucose bioxtra | Sigma Aldrich | G7528 | |
| Delta T system | Bioptechs | 0420-4 | Including temperature control, culture dishes, and perfusion setup |
| Dissection microscope- LEICA S9E | Leica | LED300 SLI | |
| DMEM/F12 | Thermo Scientific | 11039047 | Basal media without phenol red |
| Feather surgical blade (#15) | Feather | 72044-15 | |
| Fine forceps | F.S.T | 11252-23 | |
| Glutamax | Thermo Scientific | 35050-061 | Glutamine substitute |
| Leica SP8-DIVE equipped with a 25X HC IRAPO motCORR water dipping objective | Leica | n/a | |
| low-melting agarose | NuSieve | 50080 | |
| non-essential amino acids (100x) | Thermo Scientific | 11140-050 | |
| penicillin–streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Petri dish | Gen Clone | 32-107G | 90 mm |
| Rat serum | Valley Biomedical | AS3061SC | Processed for live imaging |
| Razor blade #9 | VWR | 55411-050 | |
| Scalpel handle | F.S.T | 10003-12 | |
| Scissors | F.S.T | 37133 | |
| serrated forceps | F.S.T | 11000-13 | |
| spring scissors | F.S.T | 91500-09 |
Riferimenti
- Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration. Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).
- Jing, J., et al. Rodent incisor as a model to study mesenchymal stem cells in tissue homeostasis and repair. Frontiers in Dental Medicine. 3, 1068494 (2022).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and Fgf signaling. Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
- Warshawsky, H., Smith, C. E. Morphological classification of rat incisor ameloblasts. The Anatomical Record. 179 (4), 423-445 (1974).
- Lekic, P., McCulloch, C. A. Periodontal ligament cell population: the central role of fibroblasts in creating a unique tissue. The Anatomical Record. 245 (2), 327-341 (1996).
- Takahashi, A., et al. Autocrine regulation of mesenchymal progenitor cell fates orchestrates tooth eruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (2), 575-580 (2019).
- Ness, A. R. Eruption rates of impeded and unimpeded mandibular incisors of the adult laboratory mouse. Archives of Oral Biology. 10 (3), 439-451 (1965).
- Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).
- Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137 (22), 3753-3761 (2010).
- Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).
- Biehs, B., et al. BMI1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor. Nature Cell Biology. 15, 846-852 (2013).
- Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).
- Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
- Li, L., Clevers, H. Coexistence of quiescent and active adult stem cells in mammals. Science. 327 (5965), 542-545 (2010).
- Sharir, A., et al. A large pool of actively cycling progenitors orchestrates self-renewal and injury repair of an ectodermal appendage. Nature Cell Biology. 21 (9), 1102-1112 (2019).
- Hu, J. K. -. H., et al. An FAK-YAP-mTOR signaling axis regulates stem cell-based tissue renewal in mice. Cell Stem Cell. 21 (1), 91-106 (2017).
- Yu, F., Li, F., Zheng, L., Ye, L. Epigenetic controls of Sonic hedgehog guarantee fidelity of epithelial adult stem cells trajectory in regeneration. Science Advances. 8 (29), (2022).
- An, Z., et al. A quiescent cell population replenishes mesenchymal stem cells to drive accelerated growth in mouse incisors. Nature Communications. 9 (1), 378 (2018).
- Balic, A., Thesleff, I. Tissue interactions regulating tooth development and renewal. Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).
- Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development. 147 (2), (2020).
- Krivanek, J., Buchtova, M., Fried, K., Adameyko, I. Plasticity of dental cell types in development, regeneration, and evolution. Journal of Dental Research. 102 (6), 589-598 (2023).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Cetera, M., Leybova, L., Joyce, B., Devenport, D. Counter-rotational cell flows drive morphological and cell fate asymmetries in mammalian hair follicles. Nature Cell Biology. 20 (5), 541-552 (2018).
- Held, M., Santeramo, I., Wilm, B., Murray, P., Lévy, R. Ex vivo live cell tracking in kidney organoids using light sheet fluorescence microscopy. PLoS ONE. 13 (7), 0199918 (2018).
- Mesa, K. R., et al. Homeostatic epidermal stem cell self-renewal is driven by local differentiation. Cell Stem Cell. 23 (5), 677-686 (2018).
- Mogollón, I., Ahtiainen, L. Live tissue imaging sheds light on cell level events during ectodermal organ development. Frontiers in Physiology. 11, 818 (2020).
- Prochazka, J., et al. Migration of founder epithelial cells drives proper molar tooth positioning and morphogenesis. Developmental Cell. 35 (6), 713-724 (2015).
- Morita, R., et al. Coordination of cellular dynamics contributes to tooth epithelium deformations. PLOS ONE. 11 (9), 0161336 (2016).
- Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).
- Panousopoulou, E., Green, J. B. A. Invagination of ectodermal placodes is driven by cell intercalation-mediated contraction of the suprabasal tissue canopy. PLoS biology. 14 (3), 1002405 (2016).
- Mogollón, I., Moustakas-Verho, J. E., Niittykoski, M., Ahtiainen, L. The initiation knot is a signaling center required for molar tooth development. Development. 148 (9), (2021).
- Kim, R., et al. Early perturbation of Wnt signaling reveals patterning and invagination-evagination control points in molar tooth development. Development. 148 (14), 199685 (2021).
- Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments JoVE. (90), e51969 (2014).
- Katsuragi, Y., et al. Bcl11b transcription factor plays a role in the maintenance of the ameloblast-progenitors in mouse adult maxillary incisors. Mechanisms of Development. 130 (9-10), 482-492 (2013).
- Dassule, H. R., Lewis, P., Bei, M., Maas, R., McMahon, A. P. Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth. Development. 127 (22), 4775-4785 (2000).
- Belteki, G., et al. Conditional and inducible transgene expression in mice through the combinatorial use of Cre-mediated recombination and tetracycline induction. Nucleic Acids Research. 33 (5), 51 (2005).
- Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Kimura, H., Cook, P. R. Kinetics of core histones in living human cells. The Journal of Cell Biology. 153 (7), 1341-1354 (2001).
- Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology: CB. 8 (7), 377-385 (1998).
- Huang, Q., et al. The frontier of live tissue imaging across space and time. Cell Stem Cell. 28 (4), 603-622 (2021).
- Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nature Biotechnology. 34 (11), 1137-1144 (2016).
- Knoblich, J. A. Mechanisms of asymmetric stem cell division. Cell. 132 (4), 583-597 (2008).
- Li, S., et al. Overview of the reporter genes and reporter mouse models. Animal Models and Experimental. 1 (1), 29-35 (2018).
- Mort, R. L., et al. Fucci2a: a bicistronic cell cycle reporter that allows Cre mediated tissue specific expression in mice. Cell Cycle. 13 (17), 2681-2696 (2014).
- Krivanek, J., et al. Dental cell type atlas reveals stem and differentiated cell types in mouse and human teeth. Nature Communications. 11 (1), 4816 (2020).
- Dailey, M. E., Marrs, G. S., Kurpius, D. Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup. Cold Spring Harbor protocols. 2011 (4), (2011).
- Gorczyca, W., Bruno, S., Darzynkiewicz, R., Gong, J., Darzynkiewicz, Z. DNA strand breaks occurring during apoptosis – their early insitu detection by the terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays and prevention by serine protease inhibitors. International Journal of Oncology. 1 (6), 639-648 (1992).
- Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
- Wale, P. L., Gardner, D. K. Time-lapse analysis of mouse embryo development in oxygen gradients. Reproductive Biomedicine Online. 21 (3), 402-410 (2010).
- Tse, H. M., Gardner, G., Dominguez-Bendala, J., Fraker, C. A. The importance of proper oxygenation in 3D culture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 634403 (2021).
- Spinelli, J. B., et al. Fumarate is a terminal electron acceptor in the mammalian electron transport chain. Science. 374 (6572), 1227-1237 (2021).
- Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex-vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Current Protocols in Cytometry. , (2012).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
- McCoy, R. J., O’Brien, F. J. Influence of shear stress in perfusion bioreactor cultures for the development of three-dimensional bone tissue constructs: a review. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (6), 587-601 (2010).
- Chen, K. D., et al. Mechanotransduction in response to shear stress. Roles of receptor tyrosine kinases, integrins, and Shc. The Journal of Biological Chemistry. 274 (26), 18393-18400 (1999).
- Seddiqi, H., et al. Inlet flow rate of perfusion bioreactors affects fluid flow dynamics, but not oxygen concentration in 3D-printed scaffolds for bone tissue engineering: Computational analysis and experimental validation. Computers in Biology and Medicine. 124, 103826 (2020).
