Uso de imágenes en vivo ex vivo para investigar las divisiones celulares y los movimientos durante la renovación dental del ratón

Summary

La imagen en vivo ex vivo es una técnica poderosa para estudiar los procesos dinámicos de los movimientos e interacciones celulares en los tejidos vivos. Aquí, presentamos un protocolo que implementa la microscopía de dos fotones para rastrear en vivo las células epiteliales dentales en incisivos de ratones adultos enteros cultivados.

Abstract

El incisivo de ratón en continuo crecimiento está emergiendo como un sistema modelo altamente manejable para investigar la regulación de las células madre epiteliales y mesenquimales adultas y la regeneración dental. Estas poblaciones progenitoras se dividen, se mueven y se diferencian activamente para mantener la homeostasis tisular y regenerar las células perdidas de manera receptiva. Sin embargo, los análisis tradicionales que utilizan secciones fijas de tejido no pudieron capturar los procesos dinámicos de los movimientos e interacciones celulares, lo que limitó nuestra capacidad para estudiar sus regulaciones. En este trabajo se describe un protocolo para mantener incisivos enteros de ratón en un sistema de cultivo de explantes y células epiteliales dentales de seguimiento vivo mediante microscopía de lapso de tiempo multifotónica. Esta técnica se suma a nuestra caja de herramientas existente para la investigación dental y permite a los investigadores adquirir información espacio-temporal sobre el comportamiento y las organizaciones celulares en un tejido vivo. Anticipamos que esta metodología ayudará a los investigadores a explorar más a fondo los mecanismos que controlan los procesos celulares dinámicos que tienen lugar tanto durante la renovación como durante la regeneración dental.

Introduction

En las últimas dos décadas, el incisivo de ratón se ha convertido en una plataforma inestimable para investigar los principios de la regulación de las células madre adultas y la regeneración dental ^1,2. El incisivo del ratón crece continuamente y se renueva a lo largo de la vida del animal. Lo hace mediante el mantenimiento de células madre epiteliales y mesenquimales, que pueden autorrenovarse y diferenciarse en diferentes tipos de células del diente ^1,2. Mientras que las células madre epiteliales dentales dan lugar a los ameloblastos, que secretan la matriz del esmalte, las células madre mesenquimales dentales dan lugar a odontoblastos, cementoblastos y fibroblastos, que forman la dentina, el cemento y el ligamento periodontal, respectivamente 3,4,5,6. Este suministro constante de nuevas células mantiene la homeostasis tisular y permite la reposición de células viejas que se pierden debido al desgaste masticatorio o a las lesiones ^7,8. Por lo tanto, dilucidar los mecanismos celulares y moleculares que regulan el mantenimiento y la diferenciación de las células madre dentales es fundamental para comprender la regeneración dental, un área de creciente interés.

Anatómicamente, una gran parte del incisivo del ratón adulto está encerrada en la mandíbula. Mientras el borde incisal del diente está expuesto, el extremo apical del incisivo encaja dentro de un alvéolo y está firmemente unido al hueso circundante a través de los ligamentos periodontales y los tejidos conectivos (Figura 1A, B). El extremo apical del incisivo es también la región de crecimiento del diente y mantiene las células madre y progenitoras dentales tanto en la capa epitelial como en la pulpa mesenquimal 9,10,11,12,13. Específicamente, las células madre epiteliales dentales se mantienen en el extremo bulboso del epitelio, conocido como yema apical, también conocida como asa cervical labial (Figura 1C). Al igual que el epitelio intestinal y la epidermis, la renovación epitelial en el incisivo se apoya principalmente en el ciclo activo de las células madre y sus descendientes intermedios altamente proliferativos, llamados células amplificadoras de tránsito 14,15,16,17, ambas residiendo en la parte interna del asa cervical. Sin embargo, aún no se ha determinado si el epitelio incisivo contiene y utiliza células madre quiescentes durante la regeneración. Por el contrario, se han identificado células madre mesenquimales dentales activas y quiescentes en la pulpa apical, y las células madre quiescentes funcionan como una población de reserva que se activa durante la reparación de la lesión^13,18.

Muchos de los descubrimientos sobre la biología de la renovación y regeneración de los incisivos del ratón han sido el resultado de investigaciones histológicas, en las que las muestras se obtienen en distintas coyunturas temporales, se fijan, se procesan y luego se seccionan en rodajas de una micra de espesor a lo largo de un plano particular. A través de un análisis detallado de secciones histológicas de diferentes modelos de ratón que permiten el rastreo de linajes o perturbaciones genéticas, los científicos han identificado los linajes celulares de diferentes poblaciones de progenitores, así como las vías genéticas y de señalización que controlan la homeostasis de los incisivos y la reparación de lesiones 19,20,21. Sin embargo, las imágenes estáticas bidimensionales (2D) de células no vitales en secciones no pueden capturar el espectro completo de comportamientos celulares y organizaciones espaciales en el tejido vivo, como los cambios en la forma de las células, los movimientos y la cinética celular. Detectar y medir estos cambios celulares rápidos, que ocurren en una escala de tiempo que no se puede resolver a través del corte de tejidos, requiere una estrategia diferente. Además, la adquisición de dicha información también es fundamental para comprender cómo las células dentales interactúan entre sí, reaccionan a diferentes estímulos de señalización y se autoorganizan para mantener las estructuras y funciones de los tejidos.

El advenimiento de la obtención de imágenes de tejidos profundos en cuatro dimensiones (4D) mediante microscopía de dos fotones²², una tecnología que integra tres dimensiones espaciales con resolución temporal, supera las limitaciones inherentes al análisis histológico al permitir el examen espaciotemporal de explantes de tejidos cultivados, organoides o incluso tejidos in situ 23,24,25,26 . Por ejemplo, las imágenes en vivo en 4D del epitelio dental en desarrollo han revelado los patrones espacio-temporales de las divisiones celulares y las migraciones que coordinan el crecimiento del tejido, la formación del centro de señalización y la morfogénesis epitelial dental 27,28,29,30,31,32. En el incisivo de ratón adulto, las imágenes 4D se han adaptado recientemente para estudiar los comportamientos celulares durante la reparación de lesiones epiteliales dentales. Las imágenes en vivo revelaron que las células del estrato intermedio en la capa suprabasal pueden convertirse directamente en ameloblastos en la capa basal para regenerar el epitelio dañado, desafiando el paradigma tradicional de reparación de lesiones epiteliales¹⁵.

Aquí, describimos la disección, el cultivo y la obtención de imágenes del incisivo de ratón adulto, centrándonos en las células epiteliales del asa cervical labial (Figura 1). Esta técnica preserva la vitalidad de las células dentales durante más de 12 h y permite el seguimiento en vivo de las células marcadas con fluorescencia a una resolución de una sola célula. Este enfoque permite investigar el movimiento y la migración celular, así como los cambios dinámicos en la forma celular y la orientación de la división en condiciones normales de cultivo, o en respuestas a perturbaciones genéticas, físicas y químicas.

Protocol

Todos los ratones se mantuvieron en instalaciones de animales libres de patógenos en la Universidad de California en Los Ángeles (UCLA) o la Universidad Hebrea de Jerusalén (HUJI). Todos los experimentos con ratones se realizaron de acuerdo con las normas y protocolos aprobados por el respectivo Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) (ARC-2019-013; UCLA) o (MD-23-17184-3; HUJI). En la Figura 2A se muestra un flujo de trabajo general de los pasos experimentales. Consult…

Representative Results

La región apical del incisivo del ratón adulto está encerrada dentro de la mandíbula (Figura 1) y, por lo tanto, no es directamente accesible para visualizar y rastrear en vivo las células progenitoras que residen dentro de la región de crecimiento. Por lo tanto, hemos desarrollado un método para extraer todo el incisivo de la mandíbula y mantenerlo en un sistema de cultivo de explantes para microscopía timelapse de dos fotones (Figura 2). Aquí describ…

Discussion

La imagen de tejido vivo es una técnica importante que nos permite estudiar los procesos dinámicos y el comportamiento de las células cuando se mantienen en su entorno de nicho⁴¹. Idealmente, las imágenes en vivo se realizan in vivo con una alta resolución espacio-temporal. Sin embargo, la obtención de imágenes in vivo de órganos de mamíferos puede ser un reto debido a la inaccesibilidad de los tejidos, la opacidad óptica y la dificultad para inmovilizar al animal o al …

Materials

24 well, flat bottom tissue culture plate	Olympus plastics	25-107
25x HC IRAPO motCORR water dipping objective	Leica	11507704
Ascorbic acid (Vitamin C)	Acros Organics	352685000
D-(+)-Glucose bioxtra	Sigma Aldrich	G7528
Delta T system	Bioptechs	0420-4	Including temperature control, culture dishes, and perfusion setup
Dissection microscope- LEICA S9E	Leica	LED300 SLI
DMEM/F12	Thermo Scientific	11039047	Basal media without phenol red
Feather surgical blade (#15)	Feather	72044-15
Fine forceps	F.S.T	11252-23
Glutamax	Thermo Scientific	35050-061	Glutamine substitute
Leica SP8-DIVE equipped with a 25X HC IRAPO motCORR water dipping objective	Leica	n/a
low-melting agarose	NuSieve	50080
non-essential amino acids (100x)	Thermo Scientific	11140-050
penicillin–streptomycin	Thermo Scientific	15140122	10,000 U/mL
Petri dish	Gen Clone	32-107G	90 mm
Rat serum	Valley Biomedical	AS3061SC	Processed for live imaging
Razor blade #9	VWR	55411-050
Scalpel handle	F.S.T	10003-12
Scissors	F.S.T	37133
serrated forceps	F.S.T	11000-13
spring scissors	F.S.T	91500-09