Usando imagens ao vivo ex vivo para investigar divisões celulares e movimentos durante a renovação dentária de camundongos

Summary

A imagem ao vivo ex vivo é uma técnica poderosa para estudar os processos dinâmicos de movimentos celulares e interações em tecidos vivos. Aqui, apresentamos um protocolo que implementa microscopia de dois fótons para rastrear células epiteliais dentárias vivas em incisivos adultos inteiros cultivados.

Abstract

O incisivo de camundongo em crescimento contínuo está emergindo como um sistema modelo altamente tratável para investigar a regulação de células-tronco mesenquimais e epiteliais adultas e regeneração dentária. Essas populações progenitoras dividem, movem e diferenciam ativamente para manter a homeostase tecidual e regenerar as células perdidas de maneira responsiva. No entanto, as análises tradicionais usando cortes de tecido fixo não conseguiram capturar os processos dinâmicos dos movimentos e interações celulares, limitando nossa capacidade de estudar suas regulações. Este trabalho descreve um protocolo para manter incisivos inteiros de camundongos em um sistema de cultura de explantes e células epiteliais dentárias live-track usando microscopia timelapse multifóton. Esta técnica se soma à nossa caixa de ferramentas existente para pesquisa odontológica e permite que os pesquisadores adquiram informações espaço-temporais sobre comportamentos e organizações celulares em um tecido vivo. Antecipamos que esta metodologia ajudará os pesquisadores a explorar ainda mais os mecanismos que controlam os processos celulares dinâmicos que ocorrem durante a renovação e regeneração dentária.

Introduction

Nas últimas duas décadas, o incisivo de camundongo emergiu como uma plataforma inestimável para investigar os princípios da regulação de células-tronco adultas e regeneração^dentária1,2. O incisivo de camundongo cresce continuamente e se renova ao longo da vida do animal. Para isso, mantém tanto as células-tronco epiteliais quanto as mesenquimais, que podem se auto-renovar e se diferenciar em diferentes tipos celulares do dente ^1,2. Enquanto as células-tronco epiteliais dentárias dão origem aos ameloblastos, que secretam a matriz do esmalte, as células-tronco mesenquimais dentárias dão origem aos odontoblastos, cementoblastos e fibroblastos, que formam dentina, cemento e ligamento periodontal, respectivamente 3,4,5,6. Esse fornecimento constante de novas células mantém a homeostase tecidual e permite a reposição de células antigas que são perdidas devido ao desgaste mastigatório ou^lesões7,8. A elucidação dos mecanismos celulares e moleculares que regulam a manutenção e diferenciação das células-tronco dentárias é, portanto, fundamental para o entendimento da regeneração dentária, uma área de crescente interesse.

Anatomicamente, uma grande parte do incisivo de camundongo adulto está envolta no osso maxilar. Enquanto a borda incisal do dente é exposta, a extremidade apical do incisivo se encaixa dentro de um alvéolo e está firmemente presa ao osso circundante através de ligamentos periodontais e tecidos conjuntivos (Figura 1A,B). A extremidade apical do incisivo também é a região de crescimento do dente e mantém células-tronco e progenitoras dentárias tanto na camada epitelial quanto na polpa mesenquimal9,10,11,12,13. Especificamente, as células-tronco epiteliais dentárias são mantidas na extremidade bulbosa do epitélio, conhecida como broto apical, também chamada de alça cervical labial (Figura 1C). Assim como o epitélio intestinal e a epiderme, a renovação epitelial no incisivo é suportada principalmente por células-tronco cicladoras ativas e seus descendentes intermediários altamente proliferativos, denominadas células amplificadoras do trânsito14,15,16,17, ambas residindo na parte interna da alça cervical. No entanto, ainda não se sabe se o epitélio incisivo contém e utiliza células-tronco quiescentes durante a regeneração. Em contraste, tanto as células-tronco mesenquimais dentais ativas quanto quiescentes têm sido identificadas na polpa apical, e as células-tronco quiescentes funcionam como uma população de reserva que se torna ativada durante o reparo da^lesão13,18.

Muitas das descobertas sobre a biologia da renovação e regeneração dos incisivos de camundongos resultaram de investigações histológicas, nas quais amostras são obtidas em distintas conjunturas temporais, fixadas, processadas e, em seguida, seccionadas em cortes de mícrons finos ao longo de um plano particular. Através da análise detalhada de cortes histológicos de diferentes modelos murinos que permitem o rastreamento de linhagens ou perturbações genéticas, os cientistas identificaram as linhagens celulares de diferentes populações progenitoras, bem como as vias genéticas e de sinalização que controlam a homeostase dos incisivos e o reparo de lesões 19,20,21. No entanto, as imagens bidimensionais estáticas (2D) de células não vitais em cortes não conseguem capturar todo o espectro de comportamentos celulares e organizações espaciais em tecidos vivos, como mudanças na forma celular, movimentos e cinética celular. Detectar e medir essas rápidas mudanças celulares, que ocorrem em uma escala de tempo insolúvel por meio da secção tecidual, requer uma estratégia diferente. Além disso, a aquisição dessas informações também é fundamental para a compreensão de como as células dentárias interagem entre si, reagem a diferentes estímulos de sinalização e se auto-organizam para manter as estruturas e funções teciduais.

O advento da imagem de tecidos profundos quadridimensionais (4D) utilizando microscopia de dois fótons²², uma tecnologia que integra três dimensões espaciais com resolução temporal, supera as limitações inerentes à análise histológica ao permitir o exame espaço-temporal de explantes teciduais cultivados, organoides ou mesmo tecidos in situ 23,24,25,26 . Por exemplo, imagens ao vivo em 4D do epitélio dentário em desenvolvimento revelaram os padrões espaço-temporais de divisões e migrações celulares que coordenam o crescimento tecidual, a formação do centro de sinalização e a morfogênese epitelial dentária 27,28,29,30,31,32. No incisivo adulto de camundongos, a imagem 4D foi recentemente adaptada para estudar o comportamento celular durante o reparo de lesão epitelial dentária. Imagens ao vivo revelaram que as células intermédias do estrato na camada suprabasal podem ser diretamente convertidas em ameloblastos na camada basal para regenerar o epitélio danificado, desafiando o paradigma tradicional de reparo de lesão^epitelial15.

Descrevemos a dissecção, cultivo e imagem do incisivo adulto de camundongos, com foco nas células epiteliais da alça cervical labial (Figura 1). Esta técnica preserva a vitalidade das células dentárias por mais de 12 h e permite o rastreamento ao vivo de células marcadas fluorescentemente em resolução de célula única. Esta abordagem permite a investigação do movimento e migração celular, bem como mudanças dinâmicas na forma e orientação da divisão celular sob condições normais de cultura, ou em respostas a perturbações genéticas, físicas e químicas.

Protocol

Todos os camundongos foram mantidos em instalações para animais livres de patógenos na Universidade da Califórnia em Los Angeles (UCLA) ou na Universidade Hebraica de Jerusalém (HUJI). Todos os experimentos envolvendo camundongos foram realizados de acordo com normas e protocolos aprovados pela respectiva Comissão Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) (ARC-2019-013; UCLA) ou (MD-23-17184-3; HUJI). Um fluxo de trabalho geral das etapas experimentais é mostrado na Figura 2A…

Representative Results

A região apical do incisivo adulto de camundongo está envolta dentro da mandíbula (Figura 1) e, portanto, não é diretamente acessível para visualização e rastreamento vivo das células progenitoras que residem na região de crescimento. Portanto, desenvolvemos um método para extrair todo o incisivo do osso maxilar e mantê-lo em um sistema de cultura de explantes para microscopia timelapse de dois fótons (Figura 2). Descrevemos resultados representativ…

Discussion

A imagem de tecidos vivos é uma importante técnica que permite estudar os processos dinâmicos e comportamentos das células quando mantidas em seu ambiente de nicho⁴¹. Idealmente, imagens ao vivo são realizadas in vivo com alta resolução espaço-temporal. No entanto, a obtenção de imagens in vivo para órgãos de mamíferos pode ser desafiadora devido à inacessibilidade tecidual, opacidade óptica e dificuldade de imobilização do animal ou do órgão por um período pr…

Materials

24 well, flat bottom tissue culture plate	Olympus plastics	25-107
25x HC IRAPO motCORR water dipping objective	Leica	11507704
Ascorbic acid (Vitamin C)	Acros Organics	352685000
D-(+)-Glucose bioxtra	Sigma Aldrich	G7528
Delta T system	Bioptechs	0420-4	Including temperature control, culture dishes, and perfusion setup
Dissection microscope- LEICA S9E	Leica	LED300 SLI
DMEM/F12	Thermo Scientific	11039047	Basal media without phenol red
Feather surgical blade (#15)	Feather	72044-15
Fine forceps	F.S.T	11252-23
Glutamax	Thermo Scientific	35050-061	Glutamine substitute
Leica SP8-DIVE equipped with a 25X HC IRAPO motCORR water dipping objective	Leica	n/a
low-melting agarose	NuSieve	50080
non-essential amino acids (100x)	Thermo Scientific	11140-050
penicillin–streptomycin	Thermo Scientific	15140122	10,000 U/mL
Petri dish	Gen Clone	32-107G	90 mm
Rat serum	Valley Biomedical	AS3061SC	Processed for live imaging
Razor blade #9	VWR	55411-050
Scalpel handle	F.S.T	10003-12
Scissors	F.S.T	37133
serrated forceps	F.S.T	11000-13
spring scissors	F.S.T	91500-09