JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochimica

Yüksek Çözünürlüklü Yapı Belirleme için Tek Katmanlı Grafenin Kriyo-Elektron Mikroskobu Izgaralarına Uygulanması

Published: November 10, 2023
doi:
10.3791/66023
, ,
1Department of Biology,Massachusetts Institute of Technology, 2Program in Computational and Systems Biology,Massachusetts Institute of Technology

Summary

Destek katmanlarının kriyojenik elektron mikroskobu (cryoEM) ızgaralarına uygulanması, parçacık yoğunluğunu artırabilir, hava-su arayüzü ile etkileşimleri sınırlayabilir, ışın kaynaklı hareketi azaltabilir ve parçacık yönelimlerinin dağılımını iyileştirebilir. Bu belge, gelişmiş kriyo numunesi hazırlama için cryoEM ızgaralarını tek katmanlı bir grafen ile kaplamak için sağlam bir protokolü açıklamaktadır.

Abstract

Kriyojenik elektron mikroskobunda (cryoEM), saflaştırılmış makromoleküller delikli bir karbon folyo taşıyan bir ızgaraya uygulanır; Moleküller daha sonra fazla sıvıyı uzaklaştırmak için lekelenir ve kabaca 1 μm genişliğinde folyo delikleri boyunca asılı duran kabaca 20-100 nm kalınlığında bir camsı buz tabakasında hızla dondurulur. Elde edilen numune, kriyojenik transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak görüntülenir ve uygun yazılım kullanılarak görüntü işlendikten sonra, atomik çözünürlüğe yakın yapılar belirlenebilir. cryoEM’nin yaygın olarak benimsenmesine rağmen, numune hazırlama, cryoEM iş akışlarında ciddi bir darboğaz olmaya devam ediyor ve kullanıcılar genellikle asılı camsı buzda kötü davranan numunelerle ilgili zorluklarla karşılaşıyor. Son zamanlarda, cryoEM ızgaralarını, görüntülenen alandaki parçacık yoğunluğunu sıklıkla artıran ve parçacıklar ile hava-su arayüzü arasındaki etkileşimleri azaltabilen bir destek yüzeyi görevi gören tek bir sürekli grafen tabakası ile değiştirmek için yöntemler geliştirilmiştir. Burada, grafenin cryoEM ızgaralarına uygulanması ve ortaya çıkan ızgaraların bağıl hidrofilikliğinin hızlı bir şekilde değerlendirilmesi için ayrıntılı protokoller sunuyoruz. Ek olarak, karakteristik kırınım modelini görselleştirerek grafenin varlığını doğrulamak için EM tabanlı bir yöntem açıklıyoruz. Son olarak, nispeten düşük bir konsantrasyonda saf bir numune kullanarak bir Cas9 kompleksinin 2.7 şçözünürlüklü yoğunluk haritasını hızlı bir şekilde yeniden yapılandırarak bu grafen desteklerinin faydasını gösteriyoruz.

Introduction

Tek parçacıklı kriyojenik elektron mikroskobu (cryoEM), biyolojik makromolekülleri görselleştirmek için yaygın olarak kullanılan bir yönteme dönüşmüştür1. Doğrudan elektron algılama 2,3,4, veri toplama5 ve görüntü işleme algoritmaları6,7,8,9,10’daki gelişmelerle beslenen cryoEM, artık hızla artan sayıda makromolekülün atomik çözünürlüğe yakın 3D yapılarını üretebilmektedir11. Ayrıca, yaklaşımın tek moleküllü doğasından yararlanarak, kullanıcılar tek bir örnekten 12,13,14,15 birden fazla yapı belirleyebilirve heterojen yapısal toplulukları16,17 anlamak için üretilen verileri kullanma vaadini vurgulayabilir. Bu ilerlemeye rağmen, kriyo-numune ızgarası hazırlamadaki darboğazlar devam etmektedir.

CryoEM ile yapısal karakterizasyon için, biyolojik numuneler sulu çözelti içinde iyi bir şekilde dağıtılmalı ve daha sonra vitrifikasyon18,19 adı verilen bir işlemle hızlı dondurulmalıdır. Amaç, tipik olarak amorf bir karbon tabakası halinde kesilen düzenli aralıklı delikler boyunca asılı duran düzgün bir şekilde ince bir vitrifiye buz tabakasındaki parçacıkları yakalamaktır. Bu desenli amorf karbon folyo, bakır veya altın destek çubuklarından oluşan bir ağ taşıyan bir TEM ızgarası ile desteklenir. Standart iş akışlarında, ızgaralar, numunenin uygulanmasından önce bir kızdırma deşarjı plazma işlemi kullanılarak hidrofilik hale getirilir. Fazla sıvı, filtre kağıdı ile lekelenir ve protein çözeltisinin, daldırmalı dondurma sırasında kolayca vitrifiye edilebilen delikler boyunca ince bir sıvı film oluşturmasına izin verilir. Yaygın zorluklar arasında hava-su arayüzüne (AWI) partikül lokalizasyonu ve ardından denatürasyon 20,21,22 veya tercih edilen yönlerinbenimsenmesi 23,24,25, partiküllerin deliklere göç etmek yerine karbon folyoya yapışması ve partiküllerin delikler içinde kümelenmesi ve toplanmasıyer alır 26. Düzgün olmayan buz kalınlığı başka bir endişe kaynağıdır; Kalın buz, artan elektron saçılımı nedeniyle mikrograflarda daha yüksek seviyelerde arka plan gürültüsüne neden olabilirken, aşırı ince buz daha büyük parçacıkları hariç tutabilir27.

Bu zorlukların üstesinden gelmek için, ızgara yüzeylerini kaplamak için çeşitli ince destek filmleri kullanılmıştır, bu da parçacıkların bu desteklerin üzerinde durmasına ve ideal olarak hava-su arayüzü ile etkileşimlerden kaçınmasına izin verir. Grafen destekleri, kısmen, destek katmanı28 tarafından eklenen arka plan sinyalini azaltan minimum saçılma kesiti ile birlikte yüksek mekanik mukavemetleri nedeniyle büyük umut vaat ediyor. Grafen, arka plan gürültüsüne minimum katkısına ek olarak, dikkate değer elektriksel ve termal iletkenlik sergiler29. Grafen ve grafen oksit kaplı ızgaraların daha yüksek parçacık yoğunluğu, daha düzgün parçacık dağılımı30 ve AWI22’ye daha az lokalizasyon sağladığı gösterilmiştir. Ek olarak, grafen, aşağıdakiler için daha fazla değiştirilebilen bir destek yüzeyi sağlar: 1) ızgara yüzeyinin fizyokimyasal özelliklerini işlevselleştirme yoluyla ayarlayın 31,32,33; veya 2) ilgilenilen proteinlerin afinite saflaştırılmasını kolaylaştıran çift bağlayıcı ajanlar 34,35,36.

Bu makalede, cryoEM ızgaralarını tek bir tek tip grafen30 tabakası ile kaplamak için mevcut bir prosedürü değiştirdik. Değişiklikler, verimi ve tekrarlanabilirliği artırmak amacıyla protokol boyunca şebeke kullanımını en aza indirmeyi amaçlıyor. Ek olarak, çeşitli UV/ozon tedavilerinin dalmadan önce ızgaraları hidrofilik hale getirmedeki etkinliğini değerlendirme yaklaşımımızı tartışıyoruz. Grafen kaplı ızgaralar kullanılarak kriyoEM numune hazırlamadaki bu adım kritik öneme sahiptir ve elde edilen ızgaraların nispi hidrofilikliğini ölçmek için basit yöntemimizin yararlı olduğunu gördük. Bu protokolü kullanarak, kılavuz RNA ve hedef DNA ile kompleks halinde katalitik olarak aktif olmayan S. pyogenes Cas9’un yüksek çözünürlüklü bir 3D rekonstrüksiyonunu üreterek yapı belirleme için grafen kaplı ızgaraların kullanılmasının faydasını gösteriyoruz.

Protocol

1. CVD grafenin hazırlanması Grafen aşındırma çözeltisini aşağıda açıklandığı gibi hazırlayın.4.6 g amonyum persülfatı (APS) 20 mL moleküler dereceli su içinde 1 M’lik bir çözelti için 50 mL’lik bir beherde çözün ve alüminyum folyo ile kaplayın. Adım 1.2’ye geçerken APS’nin tamamen çözülmesine izin verin. Metil metakrilat (MMA) kaplama için CVD grafenin bir bölümünü hazırlayın. CVD grafenin kare bir bölümünü dikkatlice k…

Representative Results

Burada özetlenen ekipman (Şekil 1) ve protokol (Şekil 2) kullanılarak grafen kaplı kriyoEM ızgaralarının başarılı bir şekilde üretilmesi, karakteristik kırınım modeli ile doğrulanabilen folyo deliklerini kaplayan tek bir grafen tabakası ile sonuçlanacaktır. Grafen yüzeyine protein adsorpsiyonunu teşvik etmek için, oksijen içeren fonksiyonel gruplar kurarak yüzeyi hidrofilik hale getirmek için UV/ozon işlemi kullanılabilir. Bununla bir…

Discussion

CryoEM numune hazırlama, çoğu iş akışının, araştırmacıların kırılgan ızgaralara zarar vermemek için son derece dikkatli bir şekilde manuel olarak manipüle etmelerini gerektiren bir dizi teknik zorluk içerir. Ek olarak, herhangi bir numunenin vitrifikasyona uygunluğu tahmin edilemez; Parçacıklar genellikle hava-su-arayüzü veya ızgaraları kaplayan katı destek folyosu ile etkileşime girer, bu da parçacıkların tercih edilen yönelimleri benimsemesine veya çok yüksek protein konsantrasyonları…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Örnekler, Arnold ve Mabel Beckman Vakfı sayesinde elde edilen mikroskoplarda MIT.nano’daki CryoEM Tesisinde hazırlandı ve görüntülendi. Temas açılı görüntüleme cihazları MIT Metropolis Maker Space’de basıldı. Nieng Yan ve Yimo Han’ın laboratuvarlarına ve MIT.nano personeline bu yöntemin benimsenmesi sürecindeki destekleri için teşekkür ederiz. Özellikle, anlayışlı tartışmaları ve geri bildirimleri için Dr. Guanhui Gao ve Sarah Sterling’e teşekkürlerimizi sunuyoruz. Bu çalışma, NIH hibeleri R01-GM144542, 5T32-GM007287 ve NSF-CAREER hibe 2046778 tarafından desteklenmiştir. Davis laboratuvarındaki araştırmalar Alfred P. Sloan Vakfı, James H. Ferry Fonu, MIT J-Clinic ve Whitehead Ailesi tarafından desteklenmektedir.

Materials

250 mL beaker (3x) Fisher 02-555-25B
50 mL beaker (2x) Corning 1000-50
Acetone Fisher A949-4
Aluminum foil Fisher 15-078-292
Ammonium persulfate Fisher (I17874
Coverslips 50 mm x 24 mm Mattek PCS-1.5-5024
CVD graphene Graphene Supermarket CVD-Cu-2×2
easiGlow discharger Ted-Pella 91000S
Ethanol Millipore-Sigma 1.11727
Flat-tip tweezers  Fisher 50-239-60
Glass cutter Grainger 21UE26
Glass petri plate and cover  VWR 75845-544
Glass serological pipette Fisher 13-676-34D
Grid Storage Case EMS 71146-02
Hot plate Fisher 07-770-108
Isopropanol Sigma W292907
Kimwipe Fisher 06-666
Lab scissors  Fisher 13-806-2
Methyl-Methacrylate EL-6  Kayaku MMA M310006 0500L1GL
Molecular grade water Corning 46-000-CM
Negative action tweezers (2x) Fisher 50-242-78
P20 pipette Rainin 17014392
P200 pipette Rainin 17008652 
Parafilm Fisher 13-374-12
Pipette tips Rainin 30389291
Quantifoil grids with holey carbon  EMS Q2100CR1
Spin coater  SetCas KW-4A with chuck SCA-19-23
Straightedge ULINE H-6560
Thermometer  Grainger 3LRD1
UV/Ozone cleaner  BioForce SKU: PC440
Vacuum desiccator Thomas Scientific 1159X11
Whatman paper VWR 28297-216
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Chua, E. Y. D., et al. cheaper: Recent advances in cryo-electron microscopy. Annu Rev Biochem. 91, 1-32 (2022).
  2. Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. Elife. 2, 00461 (2013).
  3. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  4. Campbell, M. G., et al. Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
  5. Cheng, A., et al. Leginon: New features and applications. Protein Sci. 30 (1), 136-150 (2021).
  6. Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).
  7. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nat Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  8. Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nat Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
  9. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. Elife. 7, 35383 (2018).
  10. Bell, J. M., Chen, M., Baldwin, P. R., Ludtke, S. J. High resolution single particle refinement in EMAN2.1. Methods. 100, 25-34 (2016).
  11. Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
  12. Kinman, L. F., Powell, B., Zhong, E., Berger, B., Davis, J. H. Uncovering structural ensembles from single particle cryo-EM data using cryoDRGN. Nat Protoc. 18 (2), 319-339 (2022).
  13. Zhong, E. D., Bepler, T., Berger, B., Davis, J. H. CryoDRGN: reconstruction of heterogeneous cryo-EM structures using neural networks. Nat Methods. 18 (2), 176-185 (2021).
  14. Chen, M., Ludtke, S. J. Deep learning-based mixed-dimensional Gaussian mixture model for characterizing variability in cryo-EM. Nat Methods. 18 (8), 930-936 (2021).
  15. Punjani, A., Fleet, D. J. 3D variability analysis: Resolving continuous flexibility and discrete heterogeneity from single particle cryo-EM. J Struct Biol. 213 (2), 107702 (2021).
  16. Dashti, A., et al. Retrieving functional pathways of biomolecules from single-particle snapshots. Nat Commun. 11 (1), 4734 (2020).
  17. Sun, J., Kinman, L. F., Jahagirdar, D., Ortega, J., Davis, J. H. KsgA facilitates ribosomal small subunit maturation by proofreading a key structural lesion. Nat Struct Mol Biol. , (2023).
  18. Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. Frozen aqueous suspensions. Ultramicroscopy. 10 (1-2), 55-61 (1982).
  19. Dubochet, J. Cryo-EM–the first thirty years. J Microsc. 245 (3), 221-224 (2012).
  20. Glaeser, R. M., et al. Factors that influence the formation and stability of thin, cryo-EM specimens. Biophys J. 110 (4), 749-755 (2016).
  21. Glaeser, R. M. Proteins, interfaces, and cryo-Em grids. Curr Opin Colloid Interface Sci. 34, 1-8 (2018).
  22. D’Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747 (2019).
  23. Tan, Y. Z., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting. Nat Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
  24. Chen, J., Noble, A. J., Kang, J. Y., Darst, S. A. Eliminating effects of particle adsorption to the air/water interface in single-particle cryo-electron microscopy: Bacterial RNA polymerase and CHAPSO. J Struct Biol X. 1, 100005 (2019).
  25. Noble, A. J., et al. Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM. Nat Methods. 15 (10), 793-795 (2018).
  26. Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74, 560-571 (2018).
  27. Neselu, K., et al. Measuring the effects of ice thickness on resolution in single particle cryo-EM. J Struct Biol X. 7, 100085 (2023).
  28. Pantelic, R. S., et al. Graphene: Substrate preparation and introduction. J Struct Biol. 174 (1), 234-238 (2011).
  29. Geim, A. K., Novoselov, K. S. The rise of graphene. Nat Mater. 6 (3), 183-191 (2007).
  30. Han, Y., et al. High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (2), 1009-1014 (2020).
  31. Fujita, J., et al. Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis. Sci Rep. 13 (1), 2279 (2023).
  32. Lu, Y., et al. Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM. Nat Commun. 13 (1), 6718 (2022).
  33. Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (24), 11718-11724 (2019).
  34. Liu, N., et al. Bioactive functionalized monolayer graphene for high-resolution cryo-electron microscopy. J Am Chem Soc. 141 (9), 4016-4025 (2019).
  35. Benjamin, C. J., et al. Selective capture of histidine-tagged proteins from cell lysates using TEM grids modified with NTA-graphene oxide. Sci Rep. 6, 32500 (2016).
  36. Wang, F., et al. General and robust covalently linked graphene oxide affinity grids for high-resolution cryo-EM. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (39), 24269-24273 (2020).
  37. Koh, A., et al. Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope. J Vis Exp. (181), (2022).
  38. Schweizer, P., et al. Mechanical cleaning of graphene using in situ electron microscopy. Nat Commun. 11 (1), 1743 (2020).
  39. Li, Z., et al. Effect of airborne contaminants on the wettability of supported graphene and graphite. Nat Mater. 12 (10), 925-931 (2013).
  40. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  41. Zhu, X., et al. Cryo-EM structures reveal coordinated domain motions that govern DNA cleavage by Cas9. Nat Struct Mol Biol. 26 (8), 679-685 (2019).
  42. Croll, T. I. ISOLDE: a physically realistic environment for model building into low-resolution electron-density maps. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74, 519-530 (2018).
  43. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  44. Prydatko, A. V., Belyaeva, L. A., Jiang, L., Lima, L. M. C., Schneider, G. F. Contact angle measurement of free-standing square-millimeter single-layer graphene. Nat Commun. 9 (1), 4185 (2018).

Tags

Cryo-electron MicroscopyGrapheneMonolayerSample PreparationParticle LocalizationAir-water InterfaceGrid SurfaceSample ConcentrationBackground NoiseAffinity HandlesCell LysatesCryogenic Electron MicroscopyHoley Carbon FoilVitreous IceImage ProcessingNear-atomic ResolutionSample Preparation BottleneckGraphene-coated Grids

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Grassetti, A. V., May, M. B., Davis, J. H. Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination. J. Vis. Exp. (201), e66023, doi:10.3791/66023 (2023).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image