Articolo metodologico

Applicazione del grafene monostrato alle griglie di microscopia crioelettronica per la determinazione della struttura ad alta risoluzione

DOI:

10.3791/66023

⸱

10 novembre 2023

 ,  , 
1Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology, 2Program in Computational and Systems Biology, Massachusetts Institute of Technology

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'applicazione di strati di supporto alle griglie di microscopia elettronica criogenica (cryoEM) può aumentare la densità delle particelle, limitare le interazioni con l'interfaccia aria-acqua, ridurre il movimento indotto dal fascio e migliorare la distribuzione degli orientamenti delle particelle. Questo documento descrive un solido protocollo per il rivestimento delle griglie crioEM con un monostrato di grafene per una migliore preparazione del campione criogenico.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nella microscopia elettronica criogenica (cryoEM), le macromolecole purificate vengono applicate a una griglia contenente una lamina di carbonio bucata; Le molecole vengono quindi tamponate per rimuovere il liquido in eccesso e congelate rapidamente in uno strato di ghiaccio vetroso spesso circa 20-100 nm, sospeso su fori di lamina larghi circa 1 μm. Il campione risultante viene ripreso utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione criogenica e, dopo l'elaborazione dell'immagine utilizzando un software adatto, è possibile determinare strutture a risoluzione quasi atomica. Nonostante l'adozione diffusa di cryoEM, la preparazione dei campioni rimane un grave collo di bottiglia nei flussi di lavoro di cryoEM, con gli utenti che spesso incontrano sfide legate ai campioni che si comportano male nel ghiaccio vitreo sospeso. Recentemente, sono stati sviluppati metodi per modificare le griglie crioEM con un singolo strato continuo di grafene, che funge da superficie di supporto che spesso aumenta la densità delle particelle nell'area ripresa e può ridurre le interazioni tra le particelle e l'interfaccia aria-acqua. Qui, forniamo protocolli dettagliati per l'applicazione del grafene alle griglie crioEM e per valutare rapidamente l'idrofilia relativa delle griglie risultanti. Inoltre, descriviamo un metodo basato su EM per confermare la presenza di grafene visualizzando il suo caratteristico modello di diffrazione. Infine, dimostriamo l'utilità di questi supporti di grafene ricostruendo rapidamente una mappa di densità con risoluzione di 2,7 Å di un complesso Cas9 utilizzando un campione puro a una concentrazione relativamente bassa.

Introduzione

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La microscopia elettronica criogenica a singola particella (cryoEM) si è evoluta in un metodo ampiamente utilizzato per la visualizzazione di macromolecole biologiche1. Alimentata dai progressi nel rilevamento diretto degli elettroni 2,3,4, nell'acquisizione dati5 e negli algoritmi di elaborazione delle immagini 6,7,8,9,10, la crioEM è ora in grado di produrre strutture 3D a risoluzione quasi atomica di un numero in rapida crescita di macromolecole11. Inoltre, sfruttando la natura a singola molecola dell'approccio, gli utenti possono determinare strutture multiple da un singolo campione 12,13,14,15, evidenziando la promessa di utilizzare i dati generati per comprendere insiemi strutturali eterogenei 16,17. Nonostante questi progressi, persistono colli di bottiglia nella preparazione della griglia dei campioni criogenici.

Per la caratterizzazione strutturale mediante crioEM, i campioni biologici devono essere ben dispersi in soluzione acquosa e quindi devono essere congelati attraverso un processo chiamato vetrificazione18,19. L'obiettivo è quello di catturare le particelle in uno strato uniformemente sottile di ghiaccio vetrificato sospeso attraverso fori regolarmente distanziati che sono tipicamente tagliati in uno strato di carbonio amorfo. Questa lamina di carbonio amorfo modellata è supportata da una griglia TEM che porta una maglia di barre di supporto in rame o oro. Nei flussi di lavoro standard, le griglie vengono rese idrofile utilizzando un trattamento al plasma a scarica luminosa prima dell'applicazione del campione. Il liquido in eccesso viene tamponato con carta da filtro, consentendo alla soluzione proteica di formare un sottile film liquido attraverso i fori che può essere prontamente vetrificato durante il surgelaggio. Le sfide più comuni includono la localizzazione delle particelle all'interfaccia aria-acqua (AWI) e la successiva denaturazione20,21,22 o l'adozione di orientamenti preferenziali 23,24,25, l'aderenza delle particelle alla lamina di carbonio piuttosto che migrare nei fori e il raggruppamento e l'aggregazione delle particelle all'interno dei fori 26. Lo spessore non uniforme del ghiaccio è un'altra preoccupazione; Il ghiaccio spesso può provocare livelli più elevati di rumore di fondo nelle micrografie a causa dell'aumento della dispersione di elettroni, mentre il ghiaccio estremamente sottile può escludere particelle più grandi27.

Per affrontare queste sfide, è stata utilizzata una varietà di sottili film di supporto per rivestire le superfici della griglia, consentendo alle particelle di riposare su questi supporti e, idealmente, evitare interazioni con l'interfaccia aria-acqua. I supporti in grafene si sono dimostrati molto promettenti, in parte grazie alla loro elevata resistenza meccanica unita alla loro minima sezione trasversale di scattering, che riduce il segnale di fondo aggiunto dallo strato di supporto28. Oltre al suo contributo minimo al rumore di fondo, il grafene presenta anche una notevole conduttività elettrica e termica29. È stato dimostrato che le griglie rivestite di grafene e ossido di grafene producono una maggiore densità di particelle, una distribuzione più uniforme delle particelle30 e una localizzazione ridotta all'AWI22. Inoltre, il grafene fornisce una superficie di supporto che può essere ulteriormente modificata per: 1) regolare le proprietà fisico-chimiche della superficie della griglia attraverso la funzionalizzazione 31,32,33; o 2) agenti leganti di coppia che facilitano la purificazione di affinità delle proteine di interesse 34,35,36.

In questo articolo, abbiamo modificato una procedura esistente per il rivestimento delle griglie cryoEM con un singolo strato uniforme di grafene30. Le modifiche mirano a ridurre al minimo la gestione della rete in tutto il protocollo, con l'obiettivo di aumentare la resa e la riproducibilità. Inoltre, discutiamo il nostro approccio per valutare l'efficacia di vari trattamenti UV/ozono nel rendere idrofile le griglie prima dell'immersione. Questa fase della preparazione dei campioni crioEM utilizzando griglie rivestite di grafene è fondamentale e abbiamo trovato utile il nostro metodo semplice per quantificare l'idrofilia relativa delle griglie risultanti. Utilizzando questo protocollo, dimostriamo l'utilità dell'impiego di griglie rivestite di grafene per la determinazione della struttura generando una ricostruzione 3D ad alta risoluzione di S. pyogenes Cas9 cataliticamente inattivo in complesso con RNA guida e DNA bersaglio.

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Protocollo

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1. Preparazione del grafene CVD

  1. Preparare la soluzione di incisione al grafene come descritto di seguito.
    1. Sciogliere 4,6 g di persolfato di ammonio (APS) in 20 mL di acqua di grado molecolare in un becher da 50 mL per una soluzione 1 M e coprire con un foglio di alluminio. Lasciare che l'APS si dissolva completamente mentre si procede al passaggio 1.2.
  2. Preparare una sezione di grafene CVD per il rivestimento in metacrilato di metile (MMA). Taglia con cura una sezione quadrata di grafene CVD. Trasferire il quadrato su un vetrino coprioggetto (50 mm x 24 mm) all'interno di una capsula di Petri pulita e coprire durante il trasporto alla centrifuga.
    NOTA: Un quadrato di 18 mm x 18 mm dovrebbe produrre 25-36 griglie rivestite di grafene.

2. Rivestimento del grafene CVD con MMA

  1. Impostare le impostazioni della centrifuga su una centrifuga ad alta velocità di 60 s a 2.500 giri/min. Posizionare con cautela il grafene CVD sul mandrino di dimensioni appropriate.
    NOTA: Idealmente, il grafene CVD si estenderà di 1-2 mm oltre il bordo del mandrino selezionato per impedire l'aspirazione di MMA nel sistema del vuoto.
  2. Premere il pulsante Take/Absorb per innestare la pompa del vuoto e fissare il grafene CVD al mandrino. Applicare MMA al centro del quadrato di grafene CVD, chiudere il coperchio e premere immediatamente il pulsante Start/Stop . Per un quadrato di 18 mm x 18 mm di grafene CVD, sono sufficienti 40 μL di MMA.
  3. Una volta che la rotazione si è fermata, disinnestare la pompa del vuoto e recuperare con cautela il grafene CVD rivestito di MMA con una pinzetta. Capovolgere il grafene CVD in modo che il lato rivestito in MMA sia rivolto verso il basso e riposizionarlo sul vetrino coprioggetti.

3. Incisione al plasma del retro in grafene

  1. Trasferire il grafene CVD sul vetrino coprioggetti nello scaricatore di incandescenza e scaricarlo per 30 s a 25 mA utilizzando una pinzetta a punta piatta.
  2. Riportare il grafene CVD sul vetrino coprioggetto nella capsula di Petri e coprire durante il trasporto nell'area di incisione del rame. Il rivestimento MMA proteggerà lo strato superiore di grafene dall'incisione al plasma.

4. Taglio di quadrati di grafene CVD rivestiti in MMA delle dimensioni di una griglia

  1. Usa due paia di pinzette per sostenere il quadrato di grafene CVD. Prendere nota dell'orientamento del quadrato di grafene CVD, tenere il lato MMA rivolto verso l'alto mentre è attaccato alle pinzette (CRITICAL).
  2. Taglia il grafene CVD in quadrati di circa 3 mm x 3 mm. Usa due serie di pinze ad azione inversa per questo passaggio per tenere il quadrato di grafene CVD con il lato destro rivolto verso l'alto e ancorarlo in posizione, e anche per tenere il bordo di un quadrato di 3 mm x 3 mm dopo averlo tagliato lontano dal resto del quadrato.

5. Dissolvenza del substrato di rame dal grafene CVD rivestito di MMA

  1. Far galleggiare con cura ogni quadrato di 3 mm x 3 mm nella soluzione APS. Entrare in contatto con la superficie della soluzione APS prima di rilasciare ogni quadrato. Inclinare il becher in modo che ogni quadrato possa essere posizionato nella soluzione con un angolo poco profondo; In questo modo si garantisce che il quadrato non affondi.
  2. Coprire il becher con un foglio di alluminio e incubare per una notte a 25 °C.

6. Rimozione di pellicole MMA/grafene dall'APS

  1. Utilizzare un vetrino coprioggetti di dimensioni 12 mm x 50 mm ed estrarre i quadrati MMA/grafene dall'APS immergendo delicatamente il vetrino coprioggetti verticalmente nell'APS e quindi spostando lateralmente il vetrino coprioggetti in modo che sia adiacente a un quadrato MMA/grafene galleggiante.
  2. Rimuovere con cautela il vetrino coprioggetto e assicurarsi che il quadrato aderisca completamente al lato del vetrino coprioggetto al momento della rimozione.
  3. Trasferire i quadrati di MMA/grafene in un becher pulito da 50 ml riempito con acqua di grado molecolare per 20 minuti. Immergere delicatamente il vetrino coprioggetto con un quadrato MMA/grafene attaccato verticalmente nell'acqua e assicurarsi che il quadrato si stacchi dal vetrino coprioggetto durante l'interazione con la superficie dell'acqua. Ripeti l'operazione per tutti i quadrati MMA/grafene.

7. Adesione del grafene alle griglie

  1. Usando una pinzetta ad azione negativa, immergi delicatamente una griglia verticalmente nell'acqua con il lato in carbonio rivolto verso un quadrato galleggiante MMA/grafene. Una volta a contatto con il quadrato, rimuovere con cautela la griglia e assicurarsi che il quadrato aderisca completamente al lato in carbonio della griglia al momento della rimozione. Ridurre al minimo il movimento laterale della griglia quando è immersa in acqua per evitare di danneggiare i quadrati della griglia (CRITICAL).
  2. Posizionare le griglie su un vetrino coprioggetti pulito con il lato MMA/grafene rivolto verso l'alto e asciugare all'aria per 1 o 2 minuti. Trasferire le griglie rivestite in grafene/MMA su una piastra riscaldante impostata a 130 °C utilizzando una pinzetta a punta piatta.
  3. Coprire con la parte superiore di una capsula di Petri di vetro e incubare per 20 min. Togliere dal fuoco e raffreddare a temperatura ambiente per 1 o 2 minuti.
    ATTENZIONE: Prestare attenzione poiché la parte superiore della piastra di Petri sarà estremamente calda.

8. Sciogliere l'MMA con l'acetone

  1. Trasferire l'intero vetrino coprioggetti in una capsula di Petri riempita con 15 ml di acetone. Incubare per 30 min.
  2. Utilizzando una pipetta sierologica di vetro pulita, trasferire l'acetone, in cui sono state incubate le griglie, in un contenitore per rifiuti. Aggiungere con cautela 15 ml di acetone fresco alla capsula di Petri utilizzando una pipetta sierologica di vetro pulita. Incubare per 30 min.
  3. Ripetere questi passaggi di lavaggio per un totale di 3 lavaggi con acetone.

9. Rimozione dell'acetone residuo con isopropanolo

  1. Dopo 3 lavaggi con acetone, rimuovere l'acetone e sostituirlo con 15 mL di isopropanolo utilizzando una pipetta sierologica di vetro pulita. Incubare per 20 min.
  2. Ripetere 3 volte per un totale di 4 lavaggi con isopropanolo. Rimuovere con cautela le griglie dall'isopropanolo e asciugare all'aria su un vetrino coprioggetto pulito usando una pinzetta.
    NOTA: L'isopropanolo residuo può rendere difficile il rilascio delle griglie dalle pinzette. Entrare in contatto tra la griglia e il vetrino coprioggetto pulito prima di rilasciare la griglia dalle pinzette può alleviare questo problema.
  3. Evaporare le sostanze organiche residue trasferendo il vetrino coprioggetto con griglie rivestite di grafene su una piastra riscaldante impostata a 100 °C per 10 min. Raffreddare a temperatura ambiente e conservare sottovuoto fino all'uso.

10. Trattamento UV/ozono di griglie rivestite di grafene

  1. Usando una pinzetta ad azione inversa, posiziona delicatamente le griglie in un'area di illuminazione pulita di un detergente UV/ozono con il lato rivestito di grafene rivolto verso l'alto.
  2. Chiudere l'area di illuminazione e accendere la macchina. Ruotare la manopola dell'ora sull'ora di trattamento designata per iniziare il trattamento UV/ozono delle griglie.
    NOTA: La durata del trattamento è un parametro regolabile, con un trattamento eccessivo che potrebbe danneggiare la griglia. Han et al.30 raccomandano 10 minuti di trattamento UV/ozono e abbiamo anche trovato un trattamento di 10 minuti sufficiente. Vedere il passaggio 12 per indicazioni sulla regolazione di questo tempo di trattamento.
  3. Procedere direttamente all'immersione di un campione crioEM sulle griglie trattate seguendo le fasi di immersione come descritto in Koh et al.37.
    NOTA: Gli idrocarburi atmosferici possono accumularsi sulla superficie della griglia dopo il trattamento UV/ozono e aumentare l'idrofobicità della superficie del grafene38,39. Per evitare ciò, immergere immediatamente le griglie trattate con UV/ozono. Può essere vantaggioso trattare le griglie UV/ozono in lotti, ad esempio, trattare sei griglie UV/ozono e immergere immediatamente quelle sei griglie, quindi trattare UV/ozono un secondo lotto di griglie, seguito dall'immersione del secondo lotto.

11. Acquisizione di un'immagine di diffrazione

  1. Assicurarsi che il microscopio sia ben sintonizzato con l'illuminazione parallela stabilita e impostare la sfocatura finale a -0,2 μm.
  2. Inserire completamente lo schermo fluorescente e l'arresto del raggio. Entra in modalità diffrazione per visualizzare chiaramente i punti di diffrazione.
  3. Acquisisci un'immagine utilizzando una telecamera CCD e valutala utilizzando un software di analisi delle immagini.
    NOTA: I punti di diffrazione più facilmente osservabili e identificabili generati da un monostrato di grafene sono 6 punti corrispondenti a una frequenza spaziale di 2,13 Å. Utilizzare uno strumento di misurazione per stimare la distanza dal centro del fascio diffratto a uno di questi punti di diffrazione in unità reciproche. In particolare 2,13 Å figure-protocol-1 0,47 Å-1.

12. Valutazione dell'idrofilia della rete

  1. Preparare la configurazione dell'imaging. Individua un supporto per telefono, una superficie di imaging da tavolo, un telefono con fotocamera, un vetrino coprioggetti e una pellicola di paraffina. Le immagini mostrate qui sono state ottenute utilizzando un supporto per telefono e una superficie di imaging da tavolo che sono stati stampati in 3D utilizzando i file .stl forniti, ottenendo misurazioni dell'angolo di contatto più facilmente riproducibili e quantificabili (Figura supplementare 1A).
  2. Stendere un vetrino coprioggetto sulla superficie piana, quindi tagliare un quadrato di 1 cm per 1 cm di pellicola di paraffina e posizionarlo sul vetrino. Posizionare il telefono sul supporto, orientando il telefono in modo che la fotocamera sia in piano con il vetrino coprioggetti. Fissare il telefono in questa posizione utilizzando elastici (Figura supplementare 1B). Scattare una foto di esempio per verificare che la fotocamera sia allineata con la superficie di imaging.
  3. Subito dopo il trattamento UV/ozono delle griglie rivestite di grafene, posizionare una singola griglia sul quadrato di pellicola di paraffina sul vetrino coprioggetto. Assicurati che il lato del grafene sia rivolto verso l'alto. Aggiungere una goccia d'acqua da 2 μL al centro della superficie della griglia con una pipetta e scattare immediatamente una foto.
    NOTA: Ripetere questo passaggio dopo: i) gli intervalli desiderati di trattamento UV/ozono per determinare una durata sufficiente del trattamento; o ii) intervalli di tempo desiderati dopo il trattamento UV/ozono per misurare quanto tempo dopo il trattamento la superficie della griglia mantiene il suo carattere idrofilo.
  4. Calcola gli angoli di contatto dalle foto importandole in ImageJ43 e utilizzando il plug-in dell'angolo di contatto.

13. Analisi di singole particelle del set di dati complesso dCas9

NOTA: Tutta l'elaborazione delle immagini descritta in questo protocollo è stata eseguita utilizzando cryoSPARC versione 4.2.1.

  1. Pre-elaborazione dei filmati utilizzando i processi di correzione del movimento delle patch e di stima CTF delle patch. Eseguire il prelievo di particelle utilizzando il processo di selezione BLOB, utilizzando un blob sferico di diametro compreso tra 115 Å e 135 Å.
  2. Estrarre le particelle utilizzando il lavoro Estrai da micrografie, utilizzando il coefficiente di correlazione normalizzato (NCC) e le soglie di potenza che si ottengono circa 200-300 particelle per micrografia. Si noti che le soglie appropriate e il numero di particelle risultante possono variare e gli utenti devono ispezionare la qualità del prelievo attraverso una serie di micrografie per identificare le condizioni adatte.
  3. Eseguire ricostruzioni iniziali multiclasse utilizzando il processo di ricostruzione Ab-initio, che richiede tre classi. Due delle tre classi conterranno probabilmente particelle non Cas9, compresi i contaminanti superficiali. Selezionare la classe simile a dCas9 per un'ulteriore elaborazione.
    NOTA: Ulteriori cicli di ricostruzione Ab-initio multiclasse o raffinamento eterogeneo possono essere applicati per perfezionare ulteriormente la pila di particelle.
  4. Eseguite l'affinamento 3D utilizzando il lavoro di rifinitura non uniforme selezionando i parametri di default. Stimare la risoluzione della ricostruzione utilizzando i lavori di convalida (FSC) e ThreeDFSC, utilizzando le mappe e la maschera del perfezionamento 3D finale.

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Risultati

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La fabbricazione di successo di griglie crioEM rivestite di grafene utilizzando l'apparecchiatura (Figura 1) e il protocollo (Figura 2) qui delineati si tradurrà in un monostrato di grafene che copre i fori della lamina che può essere confermato dal suo caratteristico modello di diffrazione. Per promuovere l'adsorbimento delle proteine sulla superficie del grafene, il trattamento UV/ozono può essere utilizzato per rendere la superficie idrofila installando grupp...

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Discussione

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La preparazione dei campioni CryoEM comporta una serie di sfide tecniche, con la maggior parte dei flussi di lavoro che richiedono ai ricercatori di manipolare manualmente le griglie fragili con estrema cura per evitare di danneggiarle. Inoltre, l'idoneità di qualsiasi campione alla vetrificazione è imprevedibile; Le particelle spesso interagiscono con l'interfaccia aria-acqua o con la lamina di supporto solida che si sovrappone alle griglie, il che può portare le particelle ad adottare gli orientamenti preferiti o a non...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I campioni sono stati preparati e sottoposti a imaging presso la CryoEM Facility di MIT.nano su microscopi acquisiti grazie alla Arnold and Mabel Beckman Foundation. I dispositivi di imaging dell'angolo di contatto sono stati stampati presso il Metropolis Maker Space del MIT. Ringraziamo i laboratori di Nieng Yan e Yimo Han e il personale del MIT.nano per il loro supporto durante l'adozione di questo metodo. In particolare, estendiamo i nostri ringraziamenti alle dottoresse Guanhui Gao e Sarah Sterling per le loro approfondite discussioni e feedback. Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni NIH R01-GM144542, 5T32-GM007287 e NSF-CAREER grant 2046778. La ricerca nel laboratorio di Davis è sostenuta dalla Alfred P. Sloan Foundation, dal James H. Ferry Fund, dalla MIT J-Clinic e dalla Whitehead Family.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Bicchiere da 250 ml (3x)Fisher02-555-25B
Bicchiere da 50 ml (2x)Corning1000-50
AcetoneFisherA949-4
Foglio di alluminioFisher15-078-292
Persolfato di ammonioFisher(I17874
Vetrini coprioggetti 50 mm x 24 mmMattekPCS-1.5-5024
CVD grafeneGrafene SupermercatoCVD-Cu-2x2
easiGlow scaricatoreTed-Pella91000S
EtanoloMillipore-Sigma1.11727
Pinzette a punta piattaFisher50-239-60
TagliavetroGrainger21UE26
Piastra di Petri in vetro e coperchio VWR75845-544
Pipetta sierologica in vetroFisher13-676-34D
Custodia a grigliaEMS71146-02
Piastra riscaldanteFisher07-770-108
IsopropanoloSigmaW292907
KimwipeFisher06-666
Forbici da laboratorio Fisher13-806-2
Metilmetacrilato EL-6 KayakuMMA M310006 0500L1GL
Acqua di grado molecolareCorning46-000-CM
Pinzetta ad azione negativa (2x)Fisher50-242-78
P20 pipettaRainin17014392
P200pipetta Rainin17008652 
ParafilmFisher13-374-12
Puntali per pipetteRainin30389291
Quantifoil griglie con carbonio forato EMSQ2100CR1
Spin coaterSetCasKW-4Acon mandrino SCA-19-23
Termometro StraightedgeULINEH-6560
 Grainger3LRD1
Pulitore UV/Ozono BioForceSKU: PC440
Essiccatore sottovuotoThomas Scientific1159X11
Carta WhatmanVWR28297-216

Riferimenti

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  1. Chua, E. Y. D., et al. cheaper: Recent advances in cryo-electron microscopy. Annu Rev Biochem. 91, 1-32 (2022).
  2. Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. Elife. 2, 00461(2013).
  3. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  4. Campbell, M. G., et al. Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
  5. Cheng, A., et al. Leginon: New features and applications. Protein Sci. 30 (1), 136-150 (2021).
  6. Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).
  7. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nat Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  8. Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nat Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
  9. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. Elife. 7, 35383(2018).
  10. Bell, J. M., Chen, M., Baldwin, P. R., Ludtke, S. J. High resolution single particle refinement in EMAN2.1. Methods. 100, 25-34 (2016).
  11. Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
  12. Kinman, L. F., Powell, B., Zhong, E., Berger, B., Davis, J. H. Uncovering structural ensembles from single particle cryo-EM data using cryoDRGN. Nat Protoc. 18 (2), 319-339 (2022).
  13. Zhong, E. D., Bepler, T., Berger, B., Davis, J. H. CryoDRGN: reconstruction of heterogeneous cryo-EM structures using neural networks. Nat Methods. 18 (2), 176-185 (2021).
  14. Chen, M., Ludtke, S. J. Deep learning-based mixed-dimensional Gaussian mixture model for characterizing variability in cryo-EM. Nat Methods. 18 (8), 930-936 (2021).
  15. Punjani, A., Fleet, D. J. 3D variability analysis: Resolving continuous flexibility and discrete heterogeneity from single particle cryo-EM. J Struct Biol. 213 (2), 107702(2021).
  16. Dashti, A., et al. Retrieving functional pathways of biomolecules from single-particle snapshots. Nat Commun. 11 (1), 4734(2020).
  17. Sun, J., Kinman, L. F., Jahagirdar, D., Ortega, J., Davis, J. H. KsgA facilitates ribosomal small subunit maturation by proofreading a key structural lesion. Nat Struct Mol Biol. , (2023).
  18. Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. Frozen aqueous suspensions. Ultramicroscopy. 10 (1-2), 55-61 (1982).
  19. Dubochet, J. Cryo-EM--the first thirty years. J Microsc. 245 (3), 221-224 (2012).
  20. Glaeser, R. M., et al. Factors that influence the formation and stability of thin, cryo-EM specimens. Biophys J. 110 (4), 749-755 (2016).
  21. Glaeser, R. M. Proteins, interfaces, and cryo-Em grids. Curr Opin Colloid Interface Sci. 34, 1-8 (2018).
  22. D'Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747(2019).
  23. Tan, Y. Z., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting. Nat Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
  24. Chen, J., Noble, A. J., Kang, J. Y., Darst, S. A. Eliminating effects of particle adsorption to the air/water interface in single-particle cryo-electron microscopy: Bacterial RNA polymerase and CHAPSO. J Struct Biol X. 1, 100005(2019).
  25. Noble, A. J., et al. Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM. Nat Methods. 15 (10), 793-795 (2018).
  26. Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74, 560-571 (2018).
  27. Neselu, K., et al. Measuring the effects of ice thickness on resolution in single particle cryo-EM. J Struct Biol X. 7, 100085(2023).
  28. Pantelic, R. S., et al. Graphene: Substrate preparation and introduction. J Struct Biol. 174 (1), 234-238 (2011).
  29. Geim, A. K., Novoselov, K. S. The rise of graphene. Nat Mater. 6 (3), 183-191 (2007).
  30. Han, Y., et al. High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (2), 1009-1014 (2020).
  31. Fujita, J., et al. Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis. Sci Rep. 13 (1), 2279(2023).
  32. Lu, Y., et al. Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM. Nat Commun. 13 (1), 6718(2022).
  33. Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (24), 11718-11724 (2019).
  34. Liu, N., et al. Bioactive functionalized monolayer graphene for high-resolution cryo-electron microscopy. J Am Chem Soc. 141 (9), 4016-4025 (2019).
  35. Benjamin, C. J., et al. Selective capture of histidine-tagged proteins from cell lysates using TEM grids modified with NTA-graphene oxide. Sci Rep. 6, 32500(2016).
  36. Wang, F., et al. General and robust covalently linked graphene oxide affinity grids for high-resolution cryo-EM. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (39), 24269-24273 (2020).
  37. Koh, A., et al. Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope. J Vis Exp. (181), (2022).
  38. Schweizer, P., et al. Mechanical cleaning of graphene using in situ electron microscopy. Nat Commun. 11 (1), 1743(2020).
  39. Li, Z., et al. Effect of airborne contaminants on the wettability of supported graphene and graphite. Nat Mater. 12 (10), 925-931 (2013).
  40. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  41. Zhu, X., et al. Cryo-EM structures reveal coordinated domain motions that govern DNA cleavage by Cas9. Nat Struct Mol Biol. 26 (8), 679-685 (2019).
  42. Croll, T. I. ISOLDE: a physically realistic environment for model building into low-resolution electron-density maps. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74, 519-530 (2018).
  43. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  44. Prydatko, A. V., Belyaeva, L. A., Jiang, L., Lima, L. M. C., Schneider, G. F. Contact angle measurement of free-standing square-millimeter single-layer graphene. Nat Commun. 9 (1), 4185(2018).

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