उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना निर्धारण के लिए क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड के लिए मोनोलेयर ग्राफीन का अनुप्रयोग
Summary
क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायोईएम) ग्रिड के लिए समर्थन परतों का अनुप्रयोग कण घनत्व को बढ़ा सकता है, वायु-जल इंटरफ़ेस के साथ बातचीत को सीमित कर सकता है, बीम-प्रेरित गति को कम कर सकता है और कण अभिविन्यास के वितरण में सुधार कर सकता है। यह पेपर बेहतर क्रायो-नमूना तैयार करने के लिए ग्राफीन के मोनोलेयर के साथ क्रायोईएम ग्रिड कोटिंग के लिए एक मजबूत प्रोटोकॉल का वर्णन करता है।
Abstract
क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायोईएम) में, शुद्ध मैक्रोमोलेक्यूल्स को एक छिद्रित कार्बन पन्नी वाले ग्रिड पर लागू किया जाता है; अणुओं को तब अतिरिक्त तरल को हटाने के लिए धब्बा लगाया जाता है और तेजी से कांच की बर्फ की लगभग 20-100 एनएम मोटी परत में जमे हुए होते हैं, जो लगभग 1 माइक्रोन चौड़े पन्नी छेद में निलंबित होते हैं। परिणामी नमूने को क्रायोजेनिक ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके चित्रित किया जाता है, और उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग करके छवि प्रसंस्करण के बाद, निकट-परमाणु रिज़ॉल्यूशन संरचनाओं को निर्धारित किया जा सकता है। क्रायोईएम के व्यापक रूप से अपनाने के बावजूद, क्रायोईएम वर्कफ़्लोज़ में नमूना तैयार करना एक गंभीर अड़चन बनी हुई है, उपयोगकर्ताओं को अक्सर निलंबित कांच की बर्फ में खराब व्यवहार करने वाले नमूनों से संबंधित चुनौतियों का सामना करना पड़ता है। हाल ही में, क्रायोईएम ग्रिड को ग्राफीन की एक निरंतर परत के साथ संशोधित करने के लिए तरीके विकसित किए गए हैं, जो एक समर्थन सतह के रूप में कार्य करता है जो अक्सर छवि वाले क्षेत्र में कण घनत्व को बढ़ाता है और कणों और वायु-जल इंटरफ़ेस के बीच बातचीत को कम कर सकता है। यहां, हम क्रायोईएम ग्रिड में ग्राफीन के आवेदन के लिए और परिणामी ग्रिड की सापेक्ष हाइड्रोफिलिसिटी का तेजी से आकलन करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इसके अतिरिक्त, हम इसकी विशेषता विवर्तन पैटर्न की कल्पना करके ग्राफीन की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए एक ईएम-आधारित विधि का वर्णन करते हैं। अंत में, हम अपेक्षाकृत कम एकाग्रता पर शुद्ध नमूने का उपयोग करके कैस 9 कॉम्प्लेक्स के 2.7 ए रिज़ॉल्यूशन घनत्व मानचित्र को तेजी से पुनर्निर्माण करके इन ग्राफीन समर्थन की उपयोगिता का प्रदर्शन करते हैं।
Introduction
एकल कण क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायोईएम) जैविक मैक्रोमोलेक्यूल्सकी कल्पना के लिए व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि में विकसित हुआ है। प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन का पता लगाने 2,3,4, डेटा अधिग्रहण5, और छवि प्रसंस्करण एल्गोरिदम 6,7,8,9,10 में प्रगति से प्रेरित, क्रायोईएम अब मैक्रोमोलेक्यूल्स 11 की तेजी से बढ़ती संख्या के निकट-परमाणु रिज़ॉल्यूशन 3 डी संरचनाओं का उत्पादन करने में सक्षम है. इसके अलावा, दृष्टिकोण के एकल अणु प्रकृति का लाभ उठाकर, उपयोगकर्ताओं को विषम संरचनात्मक पहनावा16,17 को समझने के लिए उत्पन्न डेटा का उपयोग करने के वादे पर प्रकाश डाला गया, एक ही नमूना 12,13,14,15 से कई संरचनाओं का निर्धारण कर सकते हैं. इस प्रगति के बावजूद, क्रायो-नमूना ग्रिड तैयारी में अड़चनें बनी रहती हैं।
क्रायोईएम द्वारा संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए, जैविक नमूनों को जलीय घोल में अच्छी तरह से फैलाया जाना चाहिए और फिर विट्रीफिकेशन 18,19नामक प्रक्रिया के माध्यम से फ्लैश-जमे हुए होना चाहिए। लक्ष्य नियमित रूप से दूरी वाले छेदों में निलंबित विट्रिफाइड बर्फ की एक समान पतली परत में कणों को पकड़ना है जो आमतौर पर अनाकार कार्बन की एक परत में काटे जाते हैं। यह पैटर्न वाला अनाकार कार्बन पन्नी एक टीईएम ग्रिड द्वारा समर्थित है जो तांबे या सोने के समर्थन सलाखों का एक जाल है। मानक वर्कफ़्लोज़ में, ग्रिड को नमूना के आवेदन से पहले ग्लो-डिस्चार्ज प्लाज्मा उपचार का उपयोग करके हाइड्रोफिलिक प्रदान किया जाता है। अतिरिक्त तरल को फिल्टर पेपर के साथ मिटाया जाता है, जिससे प्रोटीन समाधान को छेद में एक पतली तरल फिल्म बनाने की अनुमति मिलती है जिसे डुबकी-ठंड के दौरान आसानी से विट्रिफाइड किया जा सकता है। आम चुनौतियों में वायु-जल इंटरफ़ेस (AWI) के लिए कण स्थानीयकरण और बाद में विकृतीकरण20,21,22 या पसंदीदा अभिविन्यास 23,24,25 को अपनाना, छेद में पलायन करने के बजाय कार्बन पन्नी का कण पालन, और छेद 26 के भीतर कणों का क्लस्टरिंग और एकत्रीकरण शामिल है. गैर-समान बर्फ की मोटाई एक और चिंता का विषय है; मोटी बर्फ वृद्धि हुई इलेक्ट्रॉन बिखरने के कारण micrographs में पृष्ठभूमि शोर के उच्च स्तर में परिणाम कर सकते हैं, जबकि अत्यंत पतली बर्फ बड़े कणों27 को बाहर कर सकते हैं.
इन चुनौतियों का समाधान करने के लिए, ग्रिड सतहों को कोट करने के लिए विभिन्न प्रकार की पतली समर्थन फिल्मों का उपयोग किया गया है, जिससे कणों को इन समर्थनों पर आराम करने की अनुमति मिलती है और आदर्श रूप से, वायु-जल इंटरफ़ेस के साथ बातचीत से बचें। ग्राफीन का समर्थन करता है उनके न्यूनतम बिखरने पार अनुभाग, जो समर्थन परत28 द्वारा जोड़ा पृष्ठभूमि संकेत कम कर देता है के साथ युग्मित उनकी उच्च यांत्रिक शक्ति के कारण भाग में महान वादा दिखाया है. पृष्ठभूमि शोर के लिए अपने न्यूनतम योगदान के अलावा, ग्राफीन भी उल्लेखनीय विद्युत और तापीय चालकता29 प्रदर्शित करता है. ग्राफीन और ग्राफीन ऑक्साइड लेपित ग्रिड उच्च कण घनत्व, अधिक समान कण वितरण30, और AWI22 को कम स्थानीयकरण उपज के लिए दिखाया गया है. इसके अलावा, ग्राफीन एक समर्थन सतह प्रदान करता है जिसे आगे संशोधित किया जा सकता है: 1) कार्यात्मककरण 31,32,33 के माध्यम से ग्रिड सतह के भौतिक रासायनिक गुणों को ट्यून करें; या 2) युगल लिंकिंग एजेंट जो ब्याज34,35,36 के प्रोटीन की आत्मीयता शुद्धि की सुविधा प्रदान करते हैं।
इस लेख में, हमने ग्राफीन30 की एक समान परत के साथ क्रायोईएम ग्रिड को कोटिंग करने के लिए एक मौजूदा प्रक्रिया को संशोधित किया है। संशोधनों का उद्देश्य पूरे प्रोटोकॉल में ग्रिड हैंडलिंग को कम करना है, उपज और प्रजनन क्षमता बढ़ाने के लक्ष्य के साथ। इसके अतिरिक्त, हम डूबने से पहले ग्रिड हाइड्रोफिलिक प्रदान करने में विभिन्न यूवी / ओजोन उपचारों की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए अपने दृष्टिकोण पर चर्चा करते हैं। ग्राफीन-लेपित ग्रिड का उपयोग करके क्रायोईएम नमूना तैयार करने में यह कदम महत्वपूर्ण है, और हमने परिणामी ग्रिड की सापेक्ष हाइड्रोफिलिसिटी को उपयोगी बनाने के लिए हमारी सीधी विधि पाई है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हम गाइड आरएनए और लक्ष्य डीएनए के साथ जटिल में उत्प्रेरक रूप से निष्क्रिय एस पायोजेनेस कैस 9 के उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3 डी पुनर्निर्माण उत्पन्न करके संरचना निर्धारण के लिए ग्राफीन-लेपित ग्रिड को नियोजित करने की उपयोगिता का प्रदर्शन करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
क्रायोईएम नमूना तैयार करने में कई तकनीकी चुनौतियां शामिल हैं, जिनमें अधिकांश वर्कफ़्लोज़ के लिए शोधकर्ताओं को मैन्युअल रूप से नाजुक ग्रिड को अत्यधिक देखभाल के साथ हेरफेर करने की आवश्यकता होती है ताक…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
नमूने तैयार किए गए थे और अर्नोल्ड और माबेल बेकमैन फाउंडेशन के लिए धन्यवाद प्राप्त माइक्रोस्कोप पर MIT.nano में क्रायोईएम सुविधा में imaged थे। संपर्क कोण इमेजिंग उपकरणों को एमआईटी मेट्रोपोलिस मेकर स्पेस में मुद्रित किया गया था। हम Nieng यान और Yimo हान की प्रयोगशालाओं, और MIT.nano पर कर्मचारियों को इस पद्धति को अपनाने के दौरान उनके समर्थन के लिए धन्यवाद. विशेष रूप से, हम डॉ. गुआनहुई गाओ और सारा स्टर्लिंग को उनकी व्यावहारिक चर्चा और प्रतिक्रिया के लिए धन्यवाद देते हैं। इस काम को एनआईएच अनुदान R01-GM144542, 5T32-GM007287 और NSF-CAREER अनुदान 2046778 द्वारा समर्थित किया गया था। डेविस लैब में अनुसंधान अल्फ्रेड पी. स्लोन फाउंडेशन, जेम्स एच. फेरी फंड, एमआईटी जे-क्लिनिक और व्हाइटहेड परिवार द्वारा समर्थित है।
Materials
| 250 mL beaker (3x) | Fisher | 02-555-25B | |
| 50 mL beaker (2x) | Corning | 1000-50 | |
| Acetone | Fisher | A949-4 | |
| Aluminum foil | Fisher | 15-078-292 | |
| Ammonium persulfate | Fisher | (I17874 | |
| Coverslips 50 mm x 24 mm | Mattek | PCS-1.5-5024 | |
| CVD graphene | Graphene Supermarket | CVD-Cu-2×2 | |
| easiGlow discharger | Ted-Pella | 91000S | |
| Ethanol | Millipore-Sigma | 1.11727 | |
| Flat-tip tweezers | Fisher | 50-239-60 | |
| Glass cutter | Grainger | 21UE26 | |
| Glass petri plate and cover | VWR | 75845-544 | |
| Glass serological pipette | Fisher | 13-676-34D | |
| Grid Storage Case | EMS | 71146-02 | |
| Hot plate | Fisher | 07-770-108 | |
| Isopropanol | Sigma | W292907 | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | |
| Lab scissors | Fisher | 13-806-2 | |
| Methyl-Methacrylate EL-6 | Kayaku | MMA M310006 0500L1GL | |
| Molecular grade water | Corning | 46-000-CM | |
| Negative action tweezers (2x) | Fisher | 50-242-78 | |
| P20 pipette | Rainin | 17014392 | |
| P200 pipette | Rainin | 17008652 | |
| Parafilm | Fisher | 13-374-12 | |
| Pipette tips | Rainin | 30389291 | |
| Quantifoil grids with holey carbon | EMS | Q2100CR1 | |
| Spin coater | SetCas | KW-4A | with chuck SCA-19-23 |
| Straightedge | ULINE | H-6560 | |
| Thermometer | Grainger | 3LRD1 | |
| UV/Ozone cleaner | BioForce | SKU: PC440 | |
| Vacuum desiccator | Thomas Scientific | 1159X11 | |
| Whatman paper | VWR | 28297-216 |
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