L'applicazione di strati di supporto alle griglie di microscopia elettronica criogenica (cryoEM) può aumentare la densità delle particelle, limitare le interazioni con l'interfaccia aria-acqua, ridurre il movimento indotto dal fascio e migliorare la distribuzione degli orientamenti delle particelle. Questo documento descrive un solido protocollo per il rivestimento delle griglie crioEM con un monostrato di grafene per una migliore preparazione del campione criogenico.
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Articolo metodologico
Applicazione del grafene monostrato alle griglie di microscopia crioelettronica per la determinazione della struttura ad alta risoluzione
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Nella microscopia elettronica criogenica (cryoEM), le macromolecole purificate vengono applicate a una griglia contenente una lamina di carbonio bucata; Le molecole vengono quindi tamponate per rimuovere il liquido in eccesso e congelate rapidamente in uno strato di ghiaccio vetroso spesso circa 20-100 nm, sospeso su fori di lamina larghi circa 1 μm. Il campione risultante viene ripreso utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione criogenica e, dopo l'elaborazione dell'immagine utilizzando un software adatto, è possibile determinare strutture a risoluzione quasi atomica. Nonostante l'adozione diffusa di cryoEM, la preparazione dei campioni rimane un grave collo di bottiglia nei flussi di lavoro di cryoEM, con gli utenti che spesso incontrano sfide legate ai campioni che si comportano male nel ghiaccio vitreo sospeso. Recentemente, sono stati sviluppati metodi per modificare le griglie crioEM con un singolo strato continuo di grafene, che funge da superficie di supporto che spesso aumenta la densità delle particelle nell'area ripresa e può ridurre le interazioni tra le particelle e l'interfaccia aria-acqua. Qui, forniamo protocolli dettagliati per l'applicazione del grafene alle griglie crioEM e per valutare rapidamente l'idrofilia relativa delle griglie risultanti. Inoltre, descriviamo un metodo basato su EM per confermare la presenza di grafene visualizzando il suo caratteristico modello di diffrazione. Infine, dimostriamo l'utilità di questi supporti di grafene ricostruendo rapidamente una mappa di densità con risoluzione di 2,7 Å di un complesso Cas9 utilizzando un campione puro a una concentrazione relativamente bassa.
Introduzione
La microscopia elettronica criogenica a singola particella (cryoEM) si è evoluta in un metodo ampiamente utilizzato per la visualizzazione di macromolecole biologiche1. Alimentata dai progressi nel rilevamento diretto degli elettroni 2,3,4, nell'acquisizione dati5 e negli algoritmi di elaborazione delle immagini 6,7,8,9,10, la crioEM è ora in grado di produrre strutture 3D a risoluzione quas....
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Protocollo
1. Preparazione del grafene CVD
- Preparare la soluzione di incisione al grafene come descritto di seguito.
- Sciogliere 4,6 g di persolfato di ammonio (APS) in 20 mL di acqua di grado molecolare in un becher da 50 mL per una soluzione 1 M e coprire con un foglio di alluminio. Lasciare che l'APS si dissolva completamente mentre si procede al passaggio 1.2.
- Preparare una sezione di grafene CVD per il rivestimento in metacrilato di metile (MMA). Taglia con cura una sezione quadrata di grafene CVD. Trasferire il quadrato su un vetrino coprioggetto (50 mm x 24 mm) all'interno di una capsula di Petri pulita e coprire dura....
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Risultati
La fabbricazione di successo di griglie crioEM rivestite di grafene utilizzando l'apparecchiatura (Figura 1) e il protocollo (Figura 2) qui delineati si tradurrà in un monostrato di grafene che copre i fori della lamina che può essere confermato dal suo caratteristico modello di diffrazione. Per promuovere l'adsorbimento delle proteine sulla superficie del grafene, il trattamento UV/ozono può essere utilizzato per rendere la superficie idrofila installando grupp.......
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Discussione
La preparazione dei campioni CryoEM comporta una serie di sfide tecniche, con la maggior parte dei flussi di lavoro che richiedono ai ricercatori di manipolare manualmente le griglie fragili con estrema cura per evitare di danneggiarle. Inoltre, l'idoneità di qualsiasi campione alla vetrificazione è imprevedibile; Le particelle spesso interagiscono con l'interfaccia aria-acqua o con la lamina di supporto solida che si sovrappone alle griglie, il che può portare le particelle ad adottare gli orientamenti preferiti o a non.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti da rivelare.
Ringraziamenti
I campioni sono stati preparati e sottoposti a imaging presso la CryoEM Facility di MIT.nano su microscopi acquisiti grazie alla Arnold and Mabel Beckman Foundation. I dispositivi di imaging dell'angolo di contatto sono stati stampati presso il Metropolis Maker Space del MIT. Ringraziamo i laboratori di Nieng Yan e Yimo Han e il personale del MIT.nano per il loro supporto durante l'adozione di questo metodo. In particolare, estendiamo i nostri ringraziamenti alle dottoresse Guanhui Gao e Sarah Sterling per le loro approfondite discussioni e feedback. Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni NIH R01-GM144542, 5T32-GM007287 e NSF-CAREER grant 2046778. La ricerc....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Bicchiere da 250 ml (3x) | Fisher | 02-555-25B | |
| Bicchiere da 50 ml (2x) | Corning | 1000-50 | |
| Acetone | Fisher | A949-4 | |
| Foglio di alluminio | Fisher | 15-078-292 | |
| Persolfato di ammonio | Fisher | (I17874 | |
| Vetrini coprioggetti 50 mm x 24 mm | Mattek | PCS-1.5-5024 | |
| CVD grafene | Grafene Supermercato | CVD-Cu-2x2 | |
| easiGlow scaricatore | Ted-Pella | 91000S | |
| Etanolo | Millipore-Sigma | 1.11727 | |
| Pinzette a punta piatta | Fisher | 50-239-60 | |
| Tagliavetro | Grainger | 21UE26 | |
| Piastra di Petri in vetro e coperchio | VWR | 75845-544 | |
| Pipetta sierologica in vetro | Fisher | 13-676-34D | |
| Custodia a griglia | EMS | 71146-02 | |
| Piastra riscaldante | Fisher | 07-770-108 | |
| Isopropanolo | Sigma | W292907 | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | |
| Forbici da laboratorio | Fisher | 13-806-2 | |
| Metilmetacrilato EL-6 | Kayaku | MMA M310006 0500L1GL | |
| Acqua di grado molecolare | Corning | 46-000-CM | |
| Pinzetta ad azione negativa (2x) | Fisher | 50-242-78 | |
| P20 pipetta | Rainin | 17014392 | |
| P200 | pipetta Rainin | 17008652 | |
| Parafilm | Fisher | 13-374-12 | |
| Puntali per pipette | Rainin | 30389291 | |
| Quantifoil griglie con carbonio forato | EMS | Q2100CR1 | |
| Spin coater | SetCas | KW-4A | con mandrino SCA-19-23 |
| Termometro Straightedge | ULINE | H-6560 | |
| Grainger | 3LRD1 | ||
| Pulitore UV/Ozono | BioForce | SKU: PC440 | |
| Essiccatore sottovuoto | Thomas Scientific | 1159X11 | |
| Carta Whatman | VWR | 28297-216 |
Riferimenti
- Chua, E. Y. D., et al. cheaper: Recent advances in cryo-electron microscopy. Annu Rev Biochem. 91, 1-32 (2022).
- Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. Elife
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Ristampe e permessi
