Questo protocollo presenta un approccio ottimizzato per la produzione di modelli di ratto geneticamente modificati. Il virus adeno-associato (AAV) viene utilizzato per fornire un modello di riparazione del DNA e l'elettroporazione viene utilizzata per fornire reagenti CRISPR-Cas9 per completare il processo di editing del genoma nell'embrione a 2 cellule.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Editing del genoma CRISPR-Cas9 di embrioni di ratto utilizzando il virus adeno-associato (AAV) e l'elettroporazione di embrioni a 2 cellule
In questo articolo
Sommario
Abstract
La tecnologia di editing del genoma è ampiamente utilizzata per produrre animali geneticamente modificati, compresi i ratti. L'iniezione citoplasmatica o pronucleare di modelli di riparazione del DNA e reagenti CRISPR-Cas è il metodo di somministrazione più comune negli embrioni. Tuttavia, questo tipo di micromanipolazione richiede l'accesso ad attrezzature specializzate, è laborioso e richiede un certo livello di abilità tecnica. Inoltre, le tecniche di microiniezione spesso comportano una minore sopravvivenza dell'embrione a causa dello stress meccanico sull'embrione. In questo protocollo, abbiamo sviluppato un metodo ottimizzato per fornire modelli di riparazione del DNA di grandi dimensioni da lavorare in combinazione con l'editing del genoma CRISPR-Cas9 senza la necessità di microiniezioni. Questo protocollo combina la somministrazione di DNA mediata da AAV di modelli di donatori di DNA a singolo filamento con la somministrazione della ribonucleoproteina CRISPR-Cas9 (RNP) mediante elettroporazione per modificare gli embrioni a 2 cellule. Utilizzando questa nuova strategia, abbiamo prodotto con successo modelli mirati di ratto knock-in con inserzione di sequenze di DNA di dimensioni comprese tra 1,2 e 3,0 kb con efficienze comprese tra il 42% e il 90%.
Introduzione
Lo sviluppo di strumenti di editing del genoma basati su CRISPR ha accelerato la nostra capacità di generare in modo efficiente nuovi e più sofisticati modelli di ratti geneticamente modificati. L'RNA a guida singola, insieme alla nucleasi Cas9, viene combinato per formare complessi di ribonucleoproteina (RNP) che prendono di mira le sequenze di DNA di interesse all'interno del genoma e provocano rotture del DNA a doppio filamento. Poiché i meccanismi di riparazione del DNA cellulare sono soggetti a errori, durante il processo di riparazione vengono introdotte inserzioni e delezioni (INDEL) che possono interrompere la funzione di un gene bersaglio. Quando c'è la co-co....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università del Missouri (protocollo ACUC #25580) e sono state eseguite secondo le linee guida stabilite nella Guida per l'uso e la cura degli animali da laboratorio.
1. Somministrazione di modelli di riparazione del DNA mediati da AAV
- Progettare il costrutto del DNA in modo che contenga la sequenza di knock-in desiderata tra due bracci di omologia. Le lunghezze tipiche dei bracci di omologia sono di 300-500 bp. Assicurarsi che l'intero modello di riparazione del DNA (bracci di omologia + sequenza knock-in des....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Seguendo il protocollo, c'è un'efficace somministrazione mediata da AAV del modello di riparazione del DNA che consente un HDR altamente efficiente dopo che gli embrioni a 2 cellule sono stati elettroporati con RNP CRISPR-Cas9. Come mostrato nel video, un processo di elettroporazione riuscito provoca la formazione di bolle su ciascun elettrodo (Figura 2C) e l'impedenza rimane nell'intervallo compreso tra 0,100 e 0,300 kΩ. Dopo l'elettroporazione non è raro ch.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Il sistema di editing genomico CRISPR-Cas ha rivoluzionato il campo dell'ingegneria genetica consentendo la produzione efficiente di modificazioni genetiche personalizzate sia semplici che complesse in una varietà di specie animali. I frequenti perfezionamenti e miglioramenti nelle tecniche associate all'editing del genoma ne aumentano ulteriormente la versatilità. Qui abbiamo descritto un nuovo approccio che utilizza la somministrazione di DNA mediata da ssAAV insieme all'elettroporazione embrionale a 2 cellule dei reag.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare Nolan Davis per l'assistenza nella videografia e nel montaggio video.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Elettrocateteri con morsetti a coccodrillo per elettrodi | NepaGene | C117 | |
| Olio minerale | MilliporeSigma | M5310 | |
| NepaGene21 Super Electroporator | NepaGene | NEPA21 | |
| Elettrodi a piastra in platino su vetrino | NepaGene | CUY501P1-1.5 | |
| PURedit Cas9 Protein | MilliporeSigma | PECAS9 | |
| sgRNA (chimicamente modificato) | Synthego | N/A | |
| ssAAV1 o ssAAV6 modello di riparazione del DNA confezionato | Vectorbuilder | N/A |
Riferimenti
- Lau, C. H., Tin, C., Suh, Y. CRISPR-based strategies for targeted transgene knock-in and gene correction. Fac Rev. 9, 20(2020).
- Gutschner, T., Haemmerle, M., Genovese, G., Draetta, G. F., Chin, L. Post-translational Regulation of Cas9 during G1 Enhances Homology-Directe....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
