Denne protokollen presenterer en optimalisert tilnærming for å produsere genetisk modifiserte rottemodeller. Adenoassosiert virus (AAV) brukes til å levere en DNA-reparasjonsmal, og elektroporering brukes til å levere CRISPR-Cas9-reagenser for å fullføre genomredigeringsprosessen i 2-celleembryo.
Genomredigeringsteknologi er mye brukt til å produsere genetisk modifiserte dyr, inkludert rotter. Cytoplasmatisk eller pronukleær injeksjon av DNA-reparasjonsmaler og CRISPR-Cas-reagenser er den vanligste leveringsmetoden i embryoer. Imidlertid krever denne typen mikromanipulasjon tilgang til spesialutstyr, er arbeidskrevende og krever et visst nivå av teknisk ferdighet. Videre resulterer mikroinjeksjonsteknikker ofte i lavere embryooverlevelse på grunn av den mekaniske belastningen på embryoet. I denne protokollen utviklet vi en optimalisert metode for å levere store DNA-reparasjonsmaler for å fungere sammen med CRISPR-Cas9-genomredigering uten behov for mikroinjeksjon. Denne protokollen kombinerer AAV-mediert DNA-levering av enkeltstrengede DNA-donormaler sammen med levering av CRISPR-Cas9 ribonukleoprotein (RNP) ved elektroporering for å modifisere 2-celleembryoer. Ved hjelp av denne nye strategien har vi vellykket produsert målrettede knock-in rottemodeller som bærer innsetting av DNA-sekvenser fra 1,2 til 3,0 kb i størrelse med effektivitet mellom 42% og 90%.
Utviklingen av CRISPR-baserte genomredigeringsverktøy har akselerert vår evne til effektivt å generere nye og mer sofistikerte genetisk konstruerte rottemodeller. Enkeltveiledet RNA, sammen med Cas9-nuklease, kombineres for å danne ribonukleoprotein (RNP) komplekser som retter seg mot DNA-sekvenser av interesse i genomet og resulterer i dobbeltstrengede DNA-brudd. Fordi cellulære DNA-reparasjonsmekanismer er utsatt for feil, blir innsettinger og slettinger (INDELs) introdusert under reparasjonsprosessen som kan forstyrre et målgens funksjon. Når det er samlevering av en ønsket konstruert DNA-sekvens (reparasjonsmal) sammen med genomredigeringsreagenser, skjer innsetting av reparasjonsmalen i regionen som inneholder det dobbeltstrengede DNA-bruddet gjennom en prosess som kalles homologirettet reparasjon (HDR). Dette er en effektiv strategi for å generere dyremodeller med målrettede DNA-innsettinger/substitusjoner (knock-ins). En begrensning er at innslagssekvenser ofte er store i størrelse, noe som har vist seg å redusere genredigeringseffektiviteten, og dermed gjøredet vanskeligere å generere den ønskede modellen. Strategier for å øke knock-in effektivitet har inkludert linearisering av både dobbeltstrenget DNA (dsDNA) og enkeltstrenget DNA (ssDNA) reparasjonsmaler og kjemisk modifisering av DNA-reparasjonsmaler 2,3,4. I tillegg har pronukleær mikroinjeksjon sammen med HDR-stimulerende forbindelser, påføring av elektriske pulser i forbindelse med mikroinjeksjon og tidsbestemt mikroinjeksjon i 2-celleembryoer alle blitt forsøkt 5,6,7. Til tross for suksessen til noen av disse tilnærmingene, er inkorporering av DNA-sekvenser større enn 1,0 kb fortsatt teknisk utfordrende.
Elektroporering, som er en vanlig metode for å introdusere reagenser i dyrkede cellelinjer, tilbyr et alternativ til mikroinjeksjon for å levere CRISPR-Cas9-komponenter i embryoer. Embryoelektroporering, først demonstrert i rotteembryoer8, har siden blitt brukt som en leveringsmetode hos mus 9,10,11,12,13, griser 14,15 og andre dyremodellorganismer 16,17,18. Embryoer, suspendert i mediet som inneholder CRISPR-Cas9-reagenser, plasseres i en kyvette eller på et glassglass mellom to elektroder og underkastes direkte pulser av elektriske strømmer. Dette skaper forbigående åpninger i zona pellucida og embryoplasmamembranen gjennom hvilke CRISPR-Cas9-komponentene kommer inn i embryoene. Vanligvis brukes elektriske “poring” -pulser på mellomnivå for å lage de midlertidige åpningene etterfulgt av elektriske “overføringspulser” på lavere nivå som letter bevegelsen av de negativt ladede genomredigeringskomponentene. Embryoelektroporering er effektiv, har høy gjennomstrømning og er enkel å utføre. Imidlertid, mens embryoelektroporering har vist seg å være svært vellykket for innføring av små (<200 bp) ssDNA-reparasjonsmaler, er det få rapporter om vellykket elektroporering av større (>1,0 kb) reparasjonsmaler13,19. Denne størrelsesbegrensningen representerer en stor begrensning av embryoelektroporering for å generere innbankede dyremodeller som krever store innsettinger.
I sammenheng med genterapi har adenoassosierte virus (AAV) lenge vært brukt som kjøretøy for å levere genetisk materiale på grunn av deres effektive in vivo smittsomhet av både delende og ikke-delende celler, mangel på patogenisitet og sjelden genomisk integrasjon20,21. Nylig har flere studier kombinert AAV-er med CRISPR-Cas9-teknologi for å introdusere DNA-reparasjonsmaler og CRISPR-reagenser 22,23,24. Denne tilnærmingen tillater levering av større DNA-reparasjonsmaler uten behov for mikroinjeksjonsteknikker.
HDR-banen er mer aktiv i de sene S- og G2-fasene i cellesyklusen 25,26. I studier utført in vitro ble signifikante økninger i innslagseffektivitet oppnådd ved levering av CRISPR-Cas9 RNP og DNA-reparasjonsmaler i G2-synkroniserte celler eller ved begrensning av tilstedeværelsen av Cas9-protein til sene S- og G2-faser ved bruk av et Cas9-Geminin-fusjonsprotein2. Videre er det en stor zygotisk genomaktivering (ZGA) hendelse som oppstår under den utvidede G2-fasen av 2-cellestadiet embryo, og dette er forbundet med en åpen kromatintilstand. Det spekuleres i at dette gir CRISPR-Cas9 RNP-ene og reparasjonsmalene større tilgjengelighet til genomisk DNA.
Vårt mål var å bygge videre på alle disse observasjonene, ved å kombinere AAV-tilnærmingen med embryoelektroporering for å introdusere CRISPR-Cas9 RNP på 2-cellestadiet av embryoutvikling. Denne strategien utnytter den større leveringskapasiteten til DNA-reparasjonsmalen til AAV, den tekniske brukervennligheten til elektroporering og det mer optimale 2-celle tidspunktet for genomisk tilgjengelighet under embryoutvikling for å skape en effektiv metode for målrettet genmanipulering av DNA-innsettinger. Som fremhevet i denne protokollen, tillater vår optimaliserte metode produksjon av målrettede knock-in rottemodeller som bærer innsettinger av DNA-sekvenser fra 1,2 til 3,0 kb i størrelse uten behov for mikroinjeksjonsteknikker.
CRISPR-Cas-genomredigeringssystemet har revolusjonert feltet genteknologi ved å tillate effektiv produksjon av både enkle og komplekse, tilpassede genetiske modifikasjoner i en rekke dyrearter. Hyppige forbedringer og forbedringer i teknikker knyttet til genomredigering øker allsidigheten. Her har vi beskrevet en ny tilnærming ved bruk av ssAAV-mediert DNA-levering sammen med 2-celle embryoelektroporering av CRISPR-Cas9-reagenser i 2-celle gnagerembryoer. Vi har vist at dette er en effektiv måte å produsere målret…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil takke Nolan Davis for hjelp med videografi og videoredigering.
Leads with alligator clips for electrodes | NepaGene | C117 | |
Mineral oil | MilliporeSigma | M5310 | |
NepaGene21 Super Electroporator | NepaGene | NEPA21 | |
Platinum plate electrodes on slide glass | NepaGene | CUY501P1-1.5 | |
PURedit Cas9 Protein | MilliporeSigma | PECAS9 | |
sgRNA (chemically-modified) | Synthego | N/A | |
ssAAV1 or ssAAV6 packaged DNA repair template | Vectorbuilder | N/A |