हम एक ग्लास-आधारित, अर्ध-हाइड्रोपोनिक प्रयोगात्मक प्रणाली के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो रोगाणुओं के साथ या बिना विभिन्न प्रकार के फ़ाइलोजेनेटिक रूप से अलग-अलग पौधों के विकास का समर्थन करता है। प्रणाली विभिन्न विकास मीडिया के साथ संगत है और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए गैर-विनाशकारी रूट एक्सयूडेट नमूनाकरण की अनुमति देती है।
रूट एक्सयूडेट्स पौधे-मिट्टी के इंटरफेस को आकार देते हैं, पोषक तत्वों के चक्रण में शामिल होते हैं और मिट्टी के जीवों के साथ बातचीत को संशोधित करते हैं। रूट एक्सयूडेट्स गतिशील हैं और जैविक, पर्यावरण और प्रयोगात्मक स्थितियों द्वारा आकार दिए गए हैं। उनकी व्यापक विविधता और कम सांद्रता के कारण, सटीक एक्सयूडेट प्रोफाइल निर्धारित करने के लिए चुनौतीपूर्ण हैं, यहां तक कि प्राकृतिक वातावरण में और भी अधिक जहां अन्य जीव मौजूद हैं, पौधे से व्युत्पन्न यौगिकों को बदल रहे हैं और स्वयं अतिरिक्त यौगिकों का उत्पादन कर रहे हैं। यहां पेश की गई सेमीहाइड्रोपोनिक ग्लास जार प्रायोगिक प्रणाली जैविक, पर्यावरण और प्रयोगात्मक कारकों पर नियंत्रण की अनुमति देती है। यह विभिन्न विकास माध्यमों की एक किस्म में, रोगाणुओं के साथ या बिना कई महीनों तक विभिन्न फ़ाइलोजेनेटिक रूप से अलग-अलग पौधों की प्रजातियों के विकास की अनुमति देता है। ग्लास-आधारित डिज़ाइन उच्च संवेदनशीलता और कम पर्यावरणीय प्रभाव के लिए कम मेटाबोलाइट पृष्ठभूमि प्रदान करता है क्योंकि इसका पुन: उपयोग किया जा सकता है। एक्सयूडेट्स को गैर-विनाशकारी रूप से नमूना लिया जा सकता है, और यदि वांछित हो तो प्रयोग के दौरान स्थितियों को बदला जा सकता है। सेटअप मास स्पेक्ट्रोमेट्री एनालिटिक्स और अन्य डाउनस्ट्रीम विश्लेषणात्मक प्रक्रियाओं के साथ संगत है। संक्षेप में, हम विभिन्न स्थितियों में संवेदनशील रूट एक्सयूडेट विश्लेषण के लिए अनुकूल एक बहुमुखी विकास प्रणाली प्रस्तुत करते हैं।
घनी आबादी वाली मिट्टी के भीतर, राइजोस्फीयर एक कार्बन युक्त जगह प्रस्तुत करता है। यह 20% तक आत्मसात कार्बन के उत्सर्जन के माध्यम से पौधों की जड़ों द्वारा आकार दिया जाता है और माइक्रोबियल समुदायों को परेशान करता है जो निवासी मिट्टी माइक्रोबायोम 1,2,3,4,5,6 से अलग हैं। जैसा कि शोधकर्ता जड़ से जुड़े रोगाणुओं के लाभकारी कार्योंऔर इसके साथ जाने वाली टिकाऊ कृषि की क्षमता का दोहन कर रहे हैं, यह अवलोकन, जिसे अक्सर राइजोस्फीयर प्रभाव कहा जाता है, बढ़ते वैज्ञानिक प्रयासों का केंद्र रहा है। हालांकि, अब तक, सूक्ष्मजीवों और पौधों के बीच रासायनिक संवाद, जिसे राइजोस्फीयर प्रभाव का चालक माना जाता है, खराब समझा जाता है और इसलिए, कृषि में विश्वसनीय माइक्रोबियल समाधानों के विकास के लिए यंत्रवत समझसीमित है 8,9,10.
मिट्टी के वातावरण में जड़ का अनुमान लगाना जहां चयापचयों को मिट्टी के कणों द्वारा आसानी से अवशोषित किया जाता है और माइक्रोबियल समुदायों द्वारा जल्दी से बदल दिया जाता है, विशेष रूप से पौधों की प्रजातियों के लिए ठीक जड़ प्रणाली जैसे मॉडल प्लांट अरबिडोप्सिस थालियाना11 के साथ। यही कारण है कि, अधिकांश अध्ययनों में, हाइड्रोपोनिक सिस्टम से रूट एक्सयूडेट्स का नमूना लिया जाता है। इन सूक्ष्म जगत में, पौधों के हवाई भागों को अनुकूलित पौधे-धारकों या अधिक कम-कुंजी सामग्री जैसे जाल, अगर और कांच के मोतियों द्वारा जगह में रखा जाता है। उपयोग किए जाने वाले कंटेनर बहु-अच्छी प्लेटों पर पेट्री डिश से लेकर विभिन्न कस्टम और वाणिज्यिक बक्से तक वातन फिल्टर 12,13,14,15,16,17,18,19 के साथ या बिना हैं। प्रणाली के आधार पर, पौधे-विकास की स्थिति बहुत भिन्न होगी और प्राकृतिक परिस्थितियों को अधिक या कम हद तक प्रतिबिंबित करेगी।
यहां, हम एक ग्लास-आधारित, अर्ध-हाइड्रोपोनिक प्रणाली प्रस्तुत करते हैं जो प्रयोगात्मक रूप से उत्तरदायी है और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम उत्पन्न करता है। यह इकट्ठा करने और उपयोग करने के लिए सीधा है और आमतौर पर उपलब्ध सामग्रियों पर आधारित है। प्रणाली कांच के मोतियों से भरे ग्लास जार पर आधारित है, जो पुन: प्रयोज्य प्रकृति और कांच के बने पदार्थ (चित्रा 1) के कम-बाध्यकारी गुणों का लाभ उठाती है। मोती बढ़ते पौधे के लिए भौतिक सहायता प्रदान करते हैं और यांत्रिक प्रतिबाधा का अनुकरण करते हैं, जब हाइड्रोपोनिक सेटअप 19,20,21की तुलना में अधिक मिट्टी जैसी जड़ वास्तुकला में योगदान करते हैं। यदि रोगाणुओं के साथ टीका लगाया जाता है, तो कांच के मोती बैक्टीरिया को संलग्न करने के लिए सतहों को प्रस्तुत करते हैं।
ग्लास जार को बाँझपन बनाए रखने के लिए बंद किया जा सकता है और सिस्टम को पर्याप्त हेडस्पेस और वायु परिसंचरण की अनुमति देने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जिससे आर्द्रता में संतृप्त वातावरण से बचा जा सके। जार विभिन्न पौधों की प्रजातियों के लंबे समय तक विकास के लिए उपयुक्त हैं और विभिन्न आकार के जार का उपयोग करके ऊपर और नीचे बढ़ाया जा सकता है। यहां, छह पौधों की प्रजातियों के लिए आवेदन दिखाए गए हैं, जिसमें C3 और C4 घास, डाइकोट और फलियां शामिल हैं। उनमें से मॉडल प्रजातियां हैं ए. थालियाना (डाइकोट), ब्रैकिपोडियम डिस्टैचियन (C3 मोनोकोट), मेडिकागो ट्रंकाटुला (फलियां), साथ ही फसल प्रजातियां जैसे सोलनम लाइकोपर्सिकम (टमाटर, डाइकोट), ट्रिटिकम एस्टिवम (गेहूं, C3 मोनोकोट), और सोरघम बाइकलर (ज्वार, C4 मोनोकोट)। प्रस्तुत प्रोटोकॉल प्रणाली के प्रयोगात्मक सेटअप, बीज नसबंदी और छह पौधों की प्रजातियों के अंकुरण, जार के लिए रोपाई के प्रत्यारोपण, विभिन्न विकास मीडिया, सूक्ष्म जीव इनोक्यूलेशन, रूट एक्सयूडेट नमूनाकरण, और एनालिटिक्स के लिए एक्सयूडेट प्रोसेसिंग शामिल हैं।
यहां प्रस्तुत प्रयोगात्मक प्रणाली ग्लास जार और ग्लास मोतियों पर आधारित है और इस प्रकार विभिन्न संदर्भों में रूट एक्सयूडेशन का अध्ययन करने के लिए एक सरल, कम रखरखाव और बहुमुखी अर्धहाइड्रोपोनिक प्रणाली प्रदान करती है। इसका उपयोग विभिन्न पौधों की प्रजातियों के एक्सयूडेशन प्रोफाइल की जांच करने वाले अध्ययनों में किया गया है25, विभिन्न विकास स्थितियों के लिए एक्सयूडेशन की प्रतिक्रियाएं25, साथ ही एक्सयूडेशन22 पर मिट्टी के भौतिक रासायनिक गुणों का प्रभाव। यह प्रणाली हफ्तों से लेकर महीनों तक विस्तारित विकास अवधि के लिए यहां परीक्षण की गई सभी पौधों की प्रजातियों के लिए उपयुक्त है। बाँझ स्थितियों का रखरखाव सीधा है, जैसा कि बैक्टीरिया के साथ टीकाकरण है, जो विश्लेषण किए गए 2-सप्ताह की वृद्धि अवधि में बना रहता है। इस प्रकार, प्रयोगात्मक प्रणाली न केवल बाँझ परिस्थितियों में रूट एक्सयूडेट्स के नियंत्रित संग्रह की अनुमति देती है, बल्कि इसका उपयोग पौधे-सूक्ष्म जीव इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है। इसके अलावा, पौधे के विकास मीडिया को विभिन्न पोषक तत्वों के स्तर पर चयापचय प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए विविध किया जा सकता है, और विकास की अवधि को प्रकाश की स्थिति को अनुकूलित करके या विभिन्न आकार के जार का उपयोग करके समायोजित किया जा सकता है।
हाइड्रोपोनिक या अर्धहाइड्रोपोनिक स्थितियों में रूट exudates का अध्ययन मुख्य रूप से कम एकाग्रता चयापचयों11 की वृद्धि के संकल्प की वजह से क्षेत्र में मानक रहता है. कई हाइड्रोपोनिक दृष्टिकोण पेट्री व्यंजन, बहु-अच्छी प्लेटों, या अन्य छोटे कंटेनरों पर भरोसा करते हैं जो बाँझपन और उच्च थ्रूपुट की अनुमति देते हैं लेकिन उच्च आर्द्रता वाले वातावरण 17,18,26,27में उगाए गए छोटे पौधों या रोपाई तक प्रयोग को सीमित करते हैं। प्रस्तुत ग्लास जार सेटअप में, तुलनात्मक रूप से बड़े जार द्वारा पर्याप्त हेड स्पेस प्रदान किया जाता है, जिससे विस्तारित विकास अवधि की अनुमति मिलती है। माइक्रोपोर टेप धारियां बाँझपन बनाए रखते हुए सुरक्षित वायु विनिमय करती हैं। इस प्रकार, जौ और मक्का जैसे लंबे मोनोकॉट भी ग्लास जार सेटअप में कई हफ्तों तक उगाए जा सकते हैं। ए. थालियाना और तिपतिया घास जैसे छोटे पौधों का अंकुरण के बाद 4-5 सप्ताह तक अध्ययन किया जा सकता है, जिसमें वनस्पति और प्रजनन चरण शामिल हैं।
वैकल्पिक हाइड्रोपोनिक सेटअप बड़े पौधों के लिए भी उपलब्ध हैं, लेकिन इन्हें अक्सर प्लांट सपोर्ट 15,28,29,30 के लिए जाल, फोम बोर्ड और एनग्राफ्टमेंट बास्केट से बने कस्टम-निर्मित बक्से और इनलेट की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, इन उपकरणों को आमतौर पर बाँझ होने के लिए स्थापित नहीं किया जाता है, या उन्हें माइक्रोबियल और / या रासायनिक संदूषण से मुक्त रखने के लिए चुनौतीपूर्ण सेटअप और रखरखाव प्रक्रियाओं की आवश्यकता होती है। प्रस्तुत प्रयोगात्मक प्रणाली में बाँझपन का सेटअप और रखरखाव सीधा है। इसके अलावा, जार और मोतियों के लिए कांच का उपयोग प्लास्टिक से निकलने वाले दूषित पदार्थों की उपस्थिति को कम करता है और संसाधनों को बचाता है क्योंकि इसे आसानी से धोया और पुन: उपयोग किया जा सकता है।
मिट्टी के कणों की नकल करने के लिए पहले कांच के मोती लगाए गए हैं। वे इस तरह के एक्सयूडेशन जाल31 या अन्य अर्ध-हाइड्रोपोनिक सिस्टम19 जैसे रूट एक्सयूडेशन सैंपलिंग उपकरणों में प्राकृतिक जड़ विकास को प्रेरित करते हैं। ग्लास-जार सेटअप इस विकास का लाभ उठाता है और रोगाणुओं के लिए उपनिवेश सतह के रूप में मोतियों का परिचय देता है। मिट्टी में, पौधों की जड़ों के चारों ओर माइक्रोबायोम एक अर्धठोस वातावरण में विकसित होता है, जिसमें कॉम्पैक्ट कण और हवा या पानी से भरे स्थान होते हैं। भले ही ग्लास जार सेटअप में विकास माध्यम का सक्रिय वातन शामिल नहीं होता है, जिसके कारण निचले तरल चरण में इष्टतम ऑक्सीजन का स्तर नहीं होता है, एक छोटे विकास मध्यम मात्रा के साथ एक बड़े मनका की मात्रा का संयोजन एक आर्द्र अभी तक वातित ऊपरी चरण बनाता है जहां रोगाणु ऑक्सीक परिस्थितियों में बढ़ सकते हैं। दूसरों ने विकास कंटेनरों26,28 को हिला देने या हाइड्रोपोनिक विकास प्रणालियों में हवा की आपूर्ति बनाए रखने के लिएएयर पंप 19,29 के साथ मिलकर टयूबिंग का उपयोग करने का प्रस्ताव दिया है। हालांकि, उन प्रणालियों को या तो बाँझ नहीं होने के लिए स्थापित किया जाता है, या बाँझपन बनाए रखने के लिए विशेष सामग्री और निरंतर निगरानी की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, झटकों के मामले में, विकास समाधान में शूटिंग के डूबने और रूट सिस्टम को नुकसान से बचने के लिए बहुत देखभाल। फिर भी, यदि वांछित है, तो प्रस्तुत प्रयोगात्मक सेटअप वातन के लिए अतिरिक्त सामग्री के साथ अनुकूलित किया जा सकता है।
चयापचय की जांच करने वाले सभी पौधे-सूक्ष्म जीव इंटरैक्शन अध्ययनों पर विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण पहलू यह है कि रोगाणु पौधे-व्युत्पन्न यौगिकों को नीचा दिखाते हैं और अपने दम पर चयापचयों का उत्पादन करते हैं। एक विशेष बाँझ प्रयोगात्मक सेटअप के बिना, पौधे और सूक्ष्म जीव व्युत्पन्न चयापचयों के बीच अंतर करना संभव नहीं है। माइक्रोबियल गतिविधि को बाधित करने और पौधे व्युत्पन्न यौगिकों को समृद्ध करने के लिए, Oburger एट अल रासायनिक बैक्टीरिया के क्षरण32 को रोकने के लिए जड़ exudate नमूना समाधान निष्फल बाँझ करने के लिए प्रस्तावित. रासायनिक अवरोधकों के प्रभाव का अध्ययन प्रस्तुत प्रयोगात्मक प्रणाली में किया जा सकता है, जो अवरोधक के साथ या उसके बिना इलाज किए गए बाँझ बनाम गैर-बाँझ पौधों के एक्सयूडेशन प्रोफाइल की तुलना करता है।
प्रस्तुत ग्लास जार सेटअप की एक मुख्य सीमा यह है कि मिट्टी की तुलना में विकास की स्थिति बहुत कृत्रिम रहती है। मिट्टी उगाए पौधों से exudates अक्सर या तो percolation प्रणाली13, जहां विलायक flowthrough विकास कंटेनरों, या मिट्टी हाइड्रोपोनिक संकर प्रणालियों के आधार पर इकट्ठा कर रहे हैं जहां पौधों शुरू में मिट्टी में उगाया जाता है और फिर हाइड्रोपोनिक शर्तों16,33 करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं से एकत्र कर रहे हैं. ग्लास जार सेटअप के विपरीत, ये प्रक्रियाएं आमतौर पर विनाशकारी होती हैं, बदलते विकास वातावरण में समय के साथ कई संग्रह की अनुमति नहीं देती हैं। इसके अलावा, जबकि परकोलेटिंग सिस्टम में, मिट्टी की पृष्ठभूमि को एक्सयूडेट्स के साथ नमूना लिया जाता है, मिट्टी-हाइड्रोपोनिक हाइब्रिड सिस्टम में उच्च मिट्टी चयापचय पृष्ठभूमि की समस्या को एक्सयूडेट संग्रह के लिए हाइड्रोपोनिक स्थितियों में स्थानांतरण के साथ दरकिनार किया जाता है। हालांकि वसूली बार घायल जड़ों11 के माध्यम से मेटाबोलाइट रिसाव को कम करने के लिए लागू किया गया है, संयंत्र हस्तांतरण बहुत विघटनकारी है और घावों के बने रहने की संभावना है, और संयंत्र चयापचय हाइड्रोपोनिक शर्तों के लिए हस्तांतरण के जवाब में बदल सकता है. इसके अलावा, कई उदाहरणों में, एक आसमाटिक सदमे एक उपयुक्त विकास समाधान16,33 के बजाय पानी के लिए पौधों को स्थानांतरित करके प्रेरित है. प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, आसमाटिक संतुलन बनाए रखने के लिए एक समतुल्य समाधान के साथ विकास समाधान का आदान-प्रदान किया जाता है, फिर भी एक छोटी, परिभाषित समय खिड़की के भीतर एक्सयूडेशन को पकड़ने की अनुमति देता है। विकास समाधान का परिवर्तन कई प्रकाशित अध्ययनों में आम बात है और आसानी से 12,16,26,34 जड़ घायल बिना हाइड्रोपोनिक सेटअप में प्राप्त किया जा सकता है। इसकी बहुमुखी प्रतिभा के कारण, प्रस्तुत प्रयोगात्मक प्रणाली को आसानी से अधिक प्राकृतिक परिस्थितियों की नकल करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, ठोस मिट्टी के कणों की उपस्थिति के साथ या बिना विकास समाधान के रूप में बाँझ या गैर-बाँझ मिट्टी के अर्क का उपयोग करके। प्राकृतिक परिस्थितियों के प्रति क्रमिक परिवर्तन विभिन्न भौतिक रासायनिक मिट्टी के गुणों और पौधे के चयापचय और शरीर विज्ञान पर माइक्रोबियल उपस्थिति के प्रभाव के अध्ययन की अनुमति देता है। इससे पहले कि वैज्ञानिक समुदाय विभिन्न वातावरणों में exudation की एक अच्छी समझ है, यह समानांतर में मिट्टी आधारित और हाइड्रोपोनिक प्रणालियों को रोजगार के लिए वांछनीय है, के रूप में दोनों setups उनके फायदे और सीमाओं13.
अंत में, प्रस्तुत अर्ध-हाइड्रोपोनिक, ग्लास-आधारित प्रयोगात्मक सेटअप अनुप्रयोगों की उच्च बहुमुखी प्रतिभा के साथ संयुक्त इसकी सादगी के कारण बाहर खड़ा है। यह बाँझ परिस्थितियों में या रोगाणुओं और पौधे-सूक्ष्म जीवों के साथ संयोजन में एक्सयूडेशन को इकट्ठा करने और अध्ययन करने के लिए एक सुलभ, कम लागत वाला तरीका प्रस्तुत करता है।
The authors have nothing to disclose.
हम सीधे इंजेक्शन के साथ रूट एक्सयूडेशन प्रोफाइल का निर्धारण करने के लिए ईटीएच ज्यूरिख, स्विट्जरलैंड से प्रो डॉ निकोला ज़ाम्बोनी और प्रो डॉ उवे सॉयर और ए थालियाना कमेंसल बैक्टीरिया के लिए बेसल विश्वविद्यालय से प्रो डॉ क्लॉस श्लाप्पी को धन्यवाद देते हैं। इसके अलावा, हम स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (जेएस को PR00P3_185831, एस.एम., एस.एस., ईएमएस का समर्थन करते हुए) और पीएससी-सिंजेंटा फैलोशिप कार्यक्रम (प्रोफेसर डॉ. क्लाउस श्लाप्पी और जे.एस. को दिया गया, सीजे का समर्थन करते हुए) को स्वीकार करते हैं।
Agar powder for bacteriology | VWR | 20767.298 | |
Aluminum foil | FORA GmbH | ||
Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 32301-1KG | ACS reagent, Eur >- 98% |
Autoclave VX-150 | Systec | 1150 | |
Balance | Sartorius | QUINTIX64-1S | |
Centrifuge | Hermle Labortechnik GmbH | 305.00 V05 | |
Cuvettes | Greiner Bio-One | 613101 | |
Difco LB Broth, Lennox | BD | 240210 | |
Ethanol | Reuss-Chemie AG | RC-A15-A-005L | |
Filtered deionized water | Merck Millipore | Milli-Q IQ7000 | |
Glass beads | Carl Roth | HH56.1 | 5 mm |
Hydrochloric acid | Merk | 1.00317.1000 | |
Inoculation loop | Karl Hammacher GmbH | HWO_070-21 | |
Jars | Weck | 105741 | 850 mL |
Lyophilizer | Christ | Alpha 2-4 LSCplus | |
Magnesium chloride hexahydrate | Carl Roth | 2189.1 | |
Matrix Orbital thermoshaker | IKA | 10006248 | |
Microcentrifuge tube | Sarstedt AG & Co. KG | 72.695.500 | SafeSeal reaction tube, 2 mL, PP |
Micropore tape | 3M | 1530-0 | 1.25 cm x 9.1 m |
Micropore tape | 3M | 1530-1 | 2.5 cm x 9.1 m |
Murashige & Skoog Medium (MS) | Duchefa Biochemie | M0221.0050 | |
Growth chamber | Percival | SE41-TLCU4 | 16 hour light/8 dark. 22 °C day/18 night |
Phyto agar | Duchefa Biochemie | P1003.1000 | |
Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 8.14353.0100 | |
SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | |
Sodium hypochlorite solution, 12% Cl | Carl Roth | 9062.4 | |
Square petri dish | Greiner Bio-One | 688102 | 120x120x17 mm, with vents |
Stericup Quick release | Millipore | S2GPU05RE | 0.22 µm PES, 500 mL |
Sterile bench | FASTER S.r.l. | FlowFast H 18 |