Dispositivo di assemblaggio acustico tridimensionale per la produzione di massa di sferoidi cellulari
Summary
Gli sferoidi cellulari sono stati considerati un potenziale modello nel campo delle applicazioni biologiche. Questo articolo descrive i protocolli per la generazione scalabile di sferoidi cellulari utilizzando un dispositivo di assemblaggio acustico 3D, che fornisce un metodo efficiente per la fabbricazione robusta e rapida di sferoidi cellulari uniformi.
Abstract
Gli sferoidi cellulari sono promettenti modelli tridimensionali (3D) che hanno ottenuto ampie applicazioni in molti campi biologici. Questo protocollo presenta un metodo per la produzione di sferoidi cellulari di alta qualità e ad alto rendimento utilizzando un dispositivo di assemblaggio acustico 3D attraverso procedure manovrabili. Il dispositivo di assemblaggio acustico è costituito da tre trasduttori di titanato di zirconato di piombo (PZT), ciascuno disposto nel piano X/Y/Z di una camera quadrata in polimetilmetacrilato (PMMA). Questa configurazione consente la generazione di un modello 3D dot-array di nodi acustici levitati (LAN) quando vengono applicati tre segnali. Di conseguenza, le cellule nella soluzione di gelatina metacriloile (GelMA) possono essere guidate verso le LAN, formando aggregati cellulari uniformi in tre dimensioni. La soluzione GelMA viene quindi fotopolimerizzata ai raggi UV e reticolata per fungere da impalcatura che supporta la crescita degli aggregati cellulari. Infine, masse di sferoidi maturi vengono ottenute e recuperate dissolvendo successivamente gli scaffold GelMA in condizioni miti. Il nuovo dispositivo di assemblaggio di celle acustiche 3D proposto consentirà la fabbricazione su larga scala di sferoidi cellulari e persino di organoidi, offrendo un grande potenziale tecnologico nel campo biologico.
Introduction
I modelli di coltura 3D in vitro, che forniscono caratteristiche strutturali e morfologiche più simili a quelle in vivo rispetto ai modelli di coltura 2D convenzionali, sono stati riconosciuti come sistemi promettenti in varie applicazioni biomediche come l’ingegneria tissutale, la modellazione delle malattie e lo screening dei farmaci 1,2,3. Come un tipo di modello di coltura 3D, gli sferoidi cellulari si riferiscono tipicamente all’aggregazione cellulare, creando strutture sferoidali 3D caratterizzate da interazioni cellula-cellula e cellula-matricemigliorate 4,5,6. Pertanto, la fabbricazione di sferoidi cellulari è diventata un potente strumento per consentire diversi studi biologici.
Per ottenere sferoidi sono state sviluppate varie tecniche, tra cui la goccia sospesa7, le piastre non adesive8 o i dispositivi a micropozzetto9. In linea di principio, questi metodi facilitano comunemente l’assemblaggio delle cellule utilizzando forze fisiche come la forza gravitazionale, riducendo al minimo le interazioni tra le cellule e il substrato. Tuttavia, spesso comportano processi ad alta intensità di manodopera, hanno una bassa produttività e pongono sfide per il controllo delle dimensioni degli sferoidi10,11. È importante sottolineare che la produzione di sferoidi con le dimensioni e l’uniformità desiderate in quantità sufficiente è della massima importanza per soddisfare specifiche applicazioni biologiche. A differenza dei metodi sopra menzionati, le onde acustiche, come un tipo di tecnica guidata dalla forza esterna 12,13,14, hanno mostrato il potenziale per la produzione di massa di sferoidi cellulari di alta qualità e produttività, sulla base del principio di migliorare l’aggregazione cellulare attraverso forze esterne 15,16,17,18. A differenza delle forze elettromagnetiche o magnetiche, le tecniche di manipolazione cellulare basate sull’acustica non sono invasive e prive di marcatura, consentendo la formazione di sferoidi con un’eccellente biocompatibilità19,20.
Comunemente, sono stati sviluppati dispositivi basati su onde acustiche di superficie stazionarie (SAW) e onde acustiche di massa (BAW) per generare sferoidi, utilizzando i nodi acustici (AN) prodotti dai corrispondenti campi acustici stazionari 21,22,23. In particolare, i dispositivi di assemblaggio acustico basati su BAW, con i meriti di una produzione conveniente, di un funzionamento facile e di un’eccellente scalabilità, hanno attirato l’attenzione per la fabbricazione di sferoidi cellulari24,25. Recentemente abbiamo sviluppato un semplice dispositivo di assemblaggio acustico basato su BAW con la capacità di generare sferoidi con un’elevata produttività26. Il dispositivo proposto è costituito da una camera quadrata in polimetilmetacrilato (PMMA) con tre trasduttori in piombo zirconato titanato (PZT) disposti rispettivamente nel piano X/Y/Z. Questa disposizione consente la creazione di un modello 3D dot-array di nodi acustici levitati (LAN) per l’assemblaggio delle celle di guida. Rispetto ai dispositivi basati su BAW o SAWs precedentemente riportati, che possono creare solo un array 1D o 2D di AN 27,28,29, il presente dispositivo consente un array di punti 3D di LAN per una rapida formazione di aggregati cellulari all’interno della soluzione di metacriloile di gelatina (GelMA). Successivamente, gli aggregati cellulari sono maturati in sferoidi ad alta vitalità all’interno degli scaffold GelMA fotopolimerizzati dopo tre giorni di coltivazione. Infine, un gran numero di sferoidi di dimensioni uniformi è stato facilmente ottenuto dagli scaffold GelMA per applicazioni a valle.
Protocol
Representative Results
Discussion
La fabbricazione efficiente e stabile di sferoidi cellulari ad alta produttività utilizzando tecnologie come il dispositivo di assemblaggio acustico 3D è molto promettente per il progresso dell’ingegneria biomedica e dello screening dei farmaci 1,2,3. Questo approccio semplifica la produzione di massa di sferoidi cellulari attraverso procedure semplici.
Tuttavia, ci sono fattori critici da considera…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il suo lavoro è stato sostenuto dal National Key Research and Development Program of China (2022YFA1104600) e dalla Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (LQ23H160011).
Materials
| 0.22-μm filter | Merck | SLGSM33SS | Used for GelMA solution sterilization |
| 35 mm-cell culture dish | Corning | 430165 | Used for culturing cells |
| Confocal microscope | Nikon | A1RHD25 | Fluorescent cell observation |
| DiO dye | Beyotime | C1038 | Dye used to stain cells |
| DMEM | Gibco | 12430054 | Cell culture media |
| FBS | Gibco | 10099141C | Cell culture media supplement |
| Function generator | Rigol | DG5352 | For RF signal generation |
| GelMA | Regenovo | none | Used to prepare bioink |
| GelMA lysis buffer | EFL | EFL-GM-LS-001 | Used to dissolve GelMA scaffolds |
| Inverted microscope | Nikon | Ti-U | Cell observation |
| LAP | Sigma-Aldrich | 900889 | Used as photoinitiator |
| Live-Dead kit | Beyotime | C2015M | Cell vability analysis |
| PBS | Gibco | 10010002 | Used as buffer |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070063 | Prevent cell culture contamination |
| Power amplifer | Minicircuit | LCY-22+ | Increase the voltage amplitude of the RF signal |
| PZT transducers | Yantai Xingzhiwen Trading Co.,Ltd. | PZT-41 | Functional units for acoustic assembly device |
| T25 cell culture flask | Corning | 430639 | Used for culturing cells |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | Cell counting |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Cell dissociation enzyme |
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