Dispositivo de Montagem Acústica Tridimensional para Fabricação em Massa de Células Esferoides

Summary

Os esferoides celulares têm sido considerados um modelo potencial no campo das aplicações biológicas. Este artigo descreve protocolos para geração escalável de esferoides celulares usando um dispositivo de montagem acústica 3D, que fornece um método eficiente para a fabricação robusta e rápida de esferoides celulares uniformes.

Abstract

Os esferoides celulares são modelos tridimensionais (3D) promissores que têm ganhado amplas aplicações em muitos campos biológicos. Este protocolo apresenta um método para fabricação de esferoides celulares de alta qualidade e alto rendimento usando um dispositivo de montagem acústica 3D através de procedimentos manobráveis. O dispositivo de montagem acústica consiste de três transdutores de titanato de zirconato de chumbo (PZT), cada um disposto no plano X/Y/Z de uma câmara quadrada de polimetilmetacrilato (PMMA). Essa configuração permite a geração de um padrão 3D de nós acústicos levitados (LANs) quando três sinais são aplicados. Como resultado, as células da solução de gelatina metacriloíla (GelMA) podem ser conduzidas para as LANs, formando agregados celulares uniformes em três dimensões. A solução de GelMA é então fotocurada por UV e reticulada para servir como um andaime que suporta o crescimento de agregados celulares. Finalmente, massas de esferoides maturados são obtidas e recuperadas pela dissolução subsequente dos arcabouços de GelMA sob condições amenas. O novo dispositivo de montagem de células acústicas 3D proposto permitirá a fabricação em escala de esferoides celulares, e até mesmo organoides, oferecendo grande potencial tecnológico no campo biológico.

Introduction

Modelos de cultura 3D in vitro, que fornecem mais características estruturais e morfológicas in vivo em comparação com modelos convencionais de cultura 2D, têm sido reconhecidos como sistemas promissores em várias aplicações biomédicas, como engenharia de tecidos, modelagem de doenças e triagem de fármacos ^1,2,3. Como um tipo de modelo de cultura 3D, os esferoides celulares tipicamente se referem à agregação celular, criando estruturas esferoidais 3D caracterizadas por interações célula-célula e célula-matriz^{aumentadas 4,5,6}. Portanto, a fabricação de esferoides celulares tornou-se uma ferramenta poderosa para viabilizar diversos estudos biológicos.

Várias técnicas, incluindo gotas suspensas⁷, placas não adesivas⁸ ou dispositivos de micropoços⁹, têm sido desenvolvidas para a obtenção de esferoides. Em princípio, esses métodos geralmente facilitam a montagem celular utilizando forças físicas, como a força gravitacional, minimizando as interações entre as células e o substrato. No entanto, muitas vezes envolvem processos trabalhosos, têm baixa produtividade e representam desafios para o controle do tamanho dos esferoides^10,11. É importante ressaltar que a produção de esferoides com o tamanho desejado e uniformidade em quantidade suficiente é de extrema importância para satisfazer aplicações biológicas específicas. Em contraste com os métodos supracitados, as ondas acústicas, como um tipo de técnica de força externa 12,13,14, têm mostrado potencial para a fabricação em massa de esferoides celulares com alta qualidade e rendimento, com base no princípio de aumentar a agregação celular através de forças externas 15,16,17,18. Diferentemente das forças eletromagnéticas ou magnéticas, as técnicas de manipulação celular baseadas em acústica são não invasivas e livres de marcação, possibilitando a formação de esferoides com excelente biocompatibilidade^19,20.

Comumente, dispositivos baseados em ondas acústicas de superfície estacionária (WAS) e ondas acústicas em massa (BAWs) têm sido desenvolvidos para gerar esferoides, utilizando os nós acústicos (NAs) produzidos pelos campos acústicos estacionários correspondentes21,22,23. Particularmente, dispositivos de montagem acústica baseados em BAWs, com os méritos de fabricação conveniente, fácil operação e excelente escalabilidade, têm ganhado atenção para a fabricação de esferoides celulares ^24,25. Recentemente, desenvolvemos um dispositivo de montagem acústica fácil baseado em BAWs com a capacidade de gerar esferoides com alto rendimento²⁶. O dispositivo proposto consiste em uma câmara quadrada de polimetilmetacrilato (PMMA) com três transdutores de titanato de zirconato de chumbo (PZT) dispostos respectivamente no plano X/Y/Z. Esse arranjo permite a criação de um padrão 3D de nós acústicos levitados (LANs) para a montagem de células de condução. Em comparação com dispositivos baseados em BAWs ou SAWs relatados anteriormente, que só podem criar uma matriz 1D ou 2D de NAs 27,28,29, o presente dispositivo permite um arranjo de pontos 3D de LANs para a rápida formação de agregados celulares dentro da solução de gelatina metacriloíla (GelMA). Posteriormente, agregados celulares amadureceram em esferoides com alta viabilidade dentro dos arcabouços fotocuráveis de GelMA após três dias de cultivo. Finalmente, um grande número de esferoides com tamanho uniforme foi facilmente obtido dos scaffolds GelMA para aplicações a jusante.

Protocol

1. Fabricação do dispositivo de montagem acústica 3D Comece preparando quatro folhas de PMMA de 1 mm de espessura através de corte a laser30 e, em seguida, prossiga para colá-las para formar uma câmara quadrada com uma largura interna de 21 mm e uma altura de 10 mm. Em seguida, fixe outra folha de PMMA de 1 mm de espessura no fundo da câmara para servir como suporte para a biotinta. Afixar cuidadosamente três transdutores de titanato de zircon…

Representative Results

Este estudo projetou um dispositivo de montagem acústica 3D para fabricação em massa de esferoides celulares. O dispositivo acústico foi composto por uma câmara quadrada com dois transdutores PZT fixados no plano X e plano Y na superfície externa da câmara e um transdutor PZT na parte inferior da câmara (Figura 1A,B). Três canais de saída de dois geradores de função foram conectados a três amplificadores de potência para gerar três sinais senoidais independent…

Discussion

A fabricação eficiente e estável de esferoides celulares com alto rendimento usando tecnologias como o dispositivo de montagem acústica 3D é uma grande promessa para o avanço da engenharia biomédica e triagem de drogas ^1,2,3. Esta abordagem simplifica a produção em massa de esferoides celulares através de procedimentos simples.

No entanto, existem fatores críticos a serem considerados ao ut…

Materials

0.22-μm filter	Merck	SLGSM33SS	Used for GelMA solution sterilization
35 mm-cell culture dish	Corning	430165	Used for culturing cells
Confocal microscope	Nikon	A1RHD25	Fluorescent cell observation
DiO dye	Beyotime	C1038	Dye used to stain cells
DMEM	Gibco	12430054	Cell culture media
FBS	Gibco	10099141C	Cell culture media supplement
Function generator	Rigol	DG5352	For RF signal generation
GelMA	Regenovo	none	Used to prepare bioink
GelMA lysis buffer	EFL	EFL-GM-LS-001	Used to dissolve GelMA scaffolds
Inverted microscope	Nikon	Ti-U	Cell observation
LAP	Sigma-Aldrich	900889	Used as photoinitiator
Live-Dead kit	Beyotime	C2015M	Cell vability analysis
PBS	Gibco	10010002	Used as buffer
Penicillin-streptomycin	Gibco	15070063	Prevent cell culture contamination
Power amplifer	Minicircuit	LCY-22+	Increase the voltage amplitude of the RF signal
PZT transducers	Yantai Xingzhiwen Trading Co.,Ltd.	PZT-41	Functional units for acoustic assembly device
T25 cell culture flask	Corning	430639	Used for culturing cells
Trypan blue	Gibco	15250061	Cell counting
Trypsin-EDTA	Gibco	25200056	Cell dissociation enzyme