Isolering af primære retinale pigmentepitelceller fra svin til in vitro-modellering
Summary
Denne protokol skitserer proceduren for opnåelse og dyrkning af primære retinale pigmentepitelceller (RPE) fra lokalt fremskaffede svineøjne. Disse celler fungerer som et alternativ af høj kvalitet til stamceller og er velegnede til in vitro retinal forskning.
Abstract
Det retinale pigmentepitel (RPE) er et afgørende monolag i den ydre nethinden, der er ansvarlig for at understøtte fotoreceptorer. RPE-degeneration forekommer almindeligvis i sygdomme præget af progressivt synstab, såsom aldersrelateret makuladegeneration (AMD). Forskning i AMD er ofte afhængig af menneskelige donorøjne eller inducerede pluripotente stamceller (iPSC’er) til at repræsentere RPE. Disse RPE-kilder kræver imidlertid længere differentieringsperioder og betydelig ekspertise til dyrkning. Derudover mangler nogle forskningsinstitutioner, især dem i landdistrikterne, let adgang til donorøjne. Mens der findes en kommercielt tilgængelig udødeliggjort RPE-cellelinje (ARPE-19), mangler den væsentlige in vivo RPE-funktioner og er ikke bredt accepteret i mange oftalmologiske forskningspublikationer. Der er et presserende behov for at få repræsentative primære RPE-celler fra en lettere tilgængelig og omkostningseffektiv kilde. Denne protokol belyser isolering og subkultur af primære RPE-celler opnået post mortem fra svineøjne, som kan hentes lokalt fra kommercielle eller akademiske leverandører. Denne protokol nødvendiggør almindelige materialer, der typisk findes i vævskulturlaboratorier. Resultatet er et primært, differentieret og omkostningseffektivt alternativ til iPSC’er, menneskelige donorøjne og ARPE-19-celler.
Introduction
Det retinale pigmentepitel (RPE) er et monolag placeret i den ydre nethinden mellem Bruchs membran og fotoreceptorerne1. RPE-celler danner tætte kryds med proteiner såsom zonula occludens-1 (ZO-1) og besidder en karakteristisk fænotype karakteriseret ved pigmentering og sekskantet morfologi 2,3. Disse celler bidrager til blod-retinal barrieren og understøtter derved fotoreceptorens sundhed og opretholder retinal homeostase 4,5. Derudover spiller RPE-celler en kritisk rolle i synet ved at absorbere lys og genbruge vigtige komponenter til fotoreceptorerne6. For eksempel omdanner RPE65, et protein, der er stærkt udtrykt i RPE-celler, all-trans-retinylestere til 11-cis-retinol 7,8. I betragtning af de mange funktioner, der udføres af RPE-celler, er deres dysfunktion impliceret i forskellige sygdomme, herunder aldersrelateret makuladegeneration og diabetisk retinopati 9,10. For at øge forståelsen af retinale patologier og udvikle nye behandlinger anvendes ofte in vitro-modeller af nethinden.
For at generere repræsentative modeller af sunde eller syge nethinden er det bydende nødvendigt at bruge en mimetisk RPE-celletype. Den kommercielt tilgængelige ARPE-19-cellelinje mangler indfødte fænotyper, såsom pigmentering, mens iPSC’er kan tage måneder at differentiere 11,12,13. Selvom menneskelige donorøjne kan være ideelle, er de ofte ikke let tilgængelige for mange forskningslaboratorier.
Her har vi udtænkt en metode til at udnytte svineøjne, som deler mange ligheder med menneskelige øjne14, til opnåelse af primære RPE-celler. Disse primære svin RPE-celler er blevet brugt i flere retinale modeller15,16. Disse celler er ikke kun omkostningseffektive, men de kræver også mindre tid at erhverve end iPSC’er eller donorøjne. Derudover udviser de indfødte egenskaber, såsom pigmentering og mikrovilli. Mens lignende protokoller til porcin RPE-ekstraktion findes 17,18,19, validerer denne ligetil og detaljerede teknik yderligere enzymatisk dissociation og anvender materialer, der almindeligvis findes i de fleste cellekulturlaboratorier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver, hvordan man isolerer RPE-celler fra svineøjne. Pigmentering og brostensmorfologi ses inden for 7 dage efter isolation (figur 1B). Desuden indikerer TEER-data tæt forbindelsesdannelse22 og et sundt monolag (figur 5). Disse resultater viser, at RPE-celler isoleret med denne metode ligner human RPE og kan være gavnlige i retinale cellekulturmodeller.
Øjnene, der bruges i dette manuskr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Farhad Farjood for hjælp med svin RPE-cellekultur og isolering og Thomas Harris for hjælp med SEM. Forfatterne anerkender støtten fra Microscopy Core Facility ved Utah State University til SEM-analysen. Anlægget vedligeholder et scanningelektronmikroskop erhvervet gennem et National Science Foundation Major Research Instrumentation Grant (CMMI-1337932). Finansiering til denne undersøgelse blev leveret af et National Institutes of Health gennem Grant 1R15EY028732 (Vargis) og et BrightFocus Foundation Grant M2019109 (Vargis). Yderligere finansiering blev ydet af et Undergraduate Research and Creative Opportunities Grant (Weatherston) fra Utah State University’s Office of Research og et frøtilskud (Vargis) fra Utah State University’s Alzheimers Disease and Dementia Research Center.
Materials
| 6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass | Cellvis | P06-14-1-N | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
| Biosafety Cabinet | |||
| Calcium Chloride, Dried, Powder, 97% | Alfa Aesar | L13191.30 | |
| Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | one per eye |
| Centrifuge | |||
| Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Cooler, 8 L | Igloo | 32529 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts | Fisher Scientific | 07-200-154 | Culture inserts |
| Cut Resistant Glove | Dowellife | 712971375857 | |
| Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution | Fisher Scientific | SH3026401 | for ICC dilutions only |
| Deionized Water | |||
| DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | |
| DNase I from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
| DPBS/Modified – calcium – magnesium | Cytiva | SH3002B.02 | stored at 4 °C |
| ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex) | Quansys Biosciences, Logan, UT | ||
| ENDOHM 6 TEER device | World Precision Instruments | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 232B20 | |
| Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| Flashlight | |||
| Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem | Fisher Scientific | LC146501 | |
| Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-504 | One per eye |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen | Thermo Scientific | A32728 | RPE65 secondary antibody |
| Ice | Crushed prefered | ||
| Inverted Phase Contrast Microscope | |||
| Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | Fisher Scientific | R37605 | |
| Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5" | Cole-Palmer | EW-10818-05 | |
| Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide | Fisher Scientific | 50-822-379 | |
| LSM-710 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Petri Dish, 100 mm x 20 mm | Corning | 430167 | one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste |
| Povidone-Iondine Solution, 10% | Equate | 49035-050-34 | |
| RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen | Thermo Scientific | MA116578 | RPE65 primary antibody |
| Scalpel Blades Size 10 | Fisher Scientific | 22-079-683 | |
| Scalpel Handles Style 3 | Fisher Scientific | 50-118-4164 | |
| Surgical Drape, 18 x 26" | Fisher Scientific | 50-209-1792 | |
| Tissue Culture Incubator | 37 °C, 5% CO2, 95% Humidity | ||
| Tissue Culture Plates, 6 Wells | VWR | 10062-892 | One for eye wash and one for seeding |
| Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL | Fisher Scientific | 14-955-111F | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate | Corning | 25053Cl | |
| Tweezers Style 20A | Fisher Scientific | 17-467-231 | |
| Tweezers Style 2A | Fisher Scientific | 50-238-47 | for removing neural retina |
| Tweezers Style 5-SA-PI | Fisher Scientific | 17-467-168 | |
| Vacuum Aspiration System | |||
| Water Bath, 37 °C | |||
| ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen | Fisher Scientific | 33-911-1 | ZO-1 conjugated primary antibody |
Riferimenti
- Booij, J. C., Baas, D. C., Beisekeeva, J., Gorgels, T. G. M. F., Bergen, A. A. B. The dynamic nature of Bruch’s membrane. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (1), 1-18 (2010).
- Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases. Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).
- Georgiadis, A., et al. The tight junction associated signalling proteins ZO-1 and ZONAB regulate retinal pigment epithelium homeostasis in mice. PLOS One. 5 (12), e15730 (2010).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Yang, S., Zhou, J., Li, D. Functions and diseases of the retinal pigment epithelium. Frontiers in Pharmacology. 12, 727870 (2021).
- Moiseyev, G., Chen, Y., Takahashi, Y., Wu, B. X., Ma, J. RPE65 is the isomerohydrolase in the retinoid visual cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (35), 12413-12418 (2005).
- Uppal, S., Liu, T., Poliakov, E., Gentleman, S., Redmond, T. M. The dual roles of RPE65 S-palmitoylation in membrane association and visual cycle function. Scientific Reports. 9 (1), 5218 (2019).
- Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms. Clinical & Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).
- Xu, H. Z., Song, Z., Fu, S., Zhu, M., Le, Y. Z. RPE barrier breakdown in diabetic retinopathy: seeing is believing. Journal of Ocular Biology, Diseases, and Informatics. 4 (1-2), 83-92 (2011).
- Hellinen, L., et al. Characterization of artificially re-pigmented ARPE-19 retinal pigment epithelial cell model. Scientific Reports. 9 (1), 13761 (2019).
- Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide. Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).
- Samuel, W., et al. Appropriately differentiated ARPE-19 cells regain phenotype and gene expression profiles similar to those of native RPE cells. Molecular Vision. 23, 60-89 (2017).
- Middleton, S. Porcine ophthalmology. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 26 (3), 557-572 (2010).
- Farjood, F., Ahmadpour, A., Ostvar, S., Vargis, E. Acute mechanical stress in primary porcine RPE cells induces angiogenic factor expression and in vitro angiogenesis. Journal of Biological Engineering. 14, 13 (2020).
- Fietz, A., Hurst, J., Joachim, S. C., Schnichels, S. Establishment of a primary porcine retinal pigment epithelium monolayer to complement retinal ex vivo cultures. STAR Protocols. 4 (3), 102443 (2023).
- Hood, E. M. S., Curcio, C. A., Lipinski, D. Isolation, culture, and cryosectioning of primary porcine retinal pigment epithelium on transwell cell culture inserts. STAR Protocols. 3 (4), 101758 (2022).
- Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers. Experimental Eye Research. 124, 74-85 (2014).
- Rickabaugh, E., Weatherston, D., Harris, T. I., Jones, J. A., Vargis, E. Engineering a biomimetic in vitro model of bruch’s membrane using hagfish slime intermediate filament proteins. ACS Biomaterials Science & Engineering. 9 (8), 5051-5061 (2023).
- Harris, T. I., et al. Utilizing recombinant spider silk proteins to develop a synthetic bruch’s membrane for modeling the retinal pigment epithelium. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (8), 4023-4036 (2019).
- Zou, X. L., et al. Protection of tight junction between RPE cells with tissue factor targeting peptide. International Journal of Ophthalmology. 11 (10), 1594-1599 (2018).
