تصور البروتينات منخفضة الوفرة والتعديلات اللاحقة للترجمة في أجنة ذبابة الفاكهة الحية عن طريق حقن الأجسام المضادة الفلورية
Summary
يصف هذا البروتوكول وضع العلامات الفلورية المخصصة القائمة على الأجسام المضادة وحقنها في أجنة ذبابة الفاكهة المبكرة لتمكين التصوير المباشر للبروتينات منخفضة الوفرة أو التعديلات اللاحقة للترجمة التي يصعب اكتشافها باستخدام أساليب GFP / mCherry-tag التقليدية.
Abstract
أدى تصور البروتينات في الخلايا الحية باستخدام GFP (بروتين الفلورسنت الأخضر) وعلامات الفلورسنت الأخرى إلى تحسين فهم توطين البروتين وديناميكياته ووظيفته بشكل كبير. بالمقارنة مع التألق المناعي ، يعكس التصوير الحي بشكل أكثر دقة توطين البروتين دون حدوث قطع أثرية محتملة ناتجة عن تثبيت الأنسجة. الأهم من ذلك ، يتيح التصوير الحي التوصيف الكمي والزمني لمستويات البروتين والتوطين ، وهو أمر بالغ الأهمية لفهم العمليات البيولوجية الديناميكية مثل حركة الخلية أو انقسامها. ومع ذلك ، فإن أحد القيود الرئيسية لنهج وضع العلامات الفلورية هو الحاجة إلى مستويات تعبير عالية بما فيه الكفاية من البروتين لتحقيق تصور ناجح. وبالتالي ، لا يمكن اكتشاف العديد من البروتينات الفلورية الموسومة داخليا بمستويات تعبير منخفضة نسبيا. من ناحية أخرى ، يمكن أن يؤدي التعبير خارج الرحم باستخدام المروجين الفيروسيين في بعض الأحيان إلى سوء توطين البروتين أو تغيرات وظيفية في السياقات الفسيولوجية. لمعالجة هذه القيود ، يتم تقديم نهج يستخدم الكشف عن البروتين بوساطة الأجسام المضادة الحساسة للغاية في الأجنة الحية ، مما يؤدي بشكل أساسي إلى التألق المناعي دون الحاجة إلى تثبيت الأنسجة. كدليل على المبدأ ، يمكن تصور مستقبلات Notch الموسومة داخليا والتي بالكاد يمكن اكتشافها في الأجنة الحية بنجاح بعد حقن الأجسام المضادة. علاوة على ذلك ، تم تكييف هذا النهج لتصور تعديلات ما بعد الترجمة (PTMs) في الأجنة الحية ، مما يسمح بالكشف عن التغيرات الزمنية في أنماط فسفرة التيروزين أثناء التطور الجنيني المبكر والكشف عن مجموعة فرعية جديدة من الفوسفوتيروزين (p-Tyr) تحت الأغشية القمية. يمكن تعديل هذا النهج لاستيعاب الأجسام المضادة الأخرى الخاصة بالبروتين أو العلامات أو PTM ويجب أن يكون متوافقا مع الكائنات الحية النموذجية الأخرى القابلة للحقن أو خطوط الخلايا. يفتح هذا البروتوكول إمكانيات جديدة للتصوير الحي للبروتينات منخفضة الوفرة أو PTMs التي كان من الصعب اكتشافها في السابق باستخدام طرق وضع العلامات الفلورية التقليدية.
Introduction
التألق المناعي هو تقنية أساسية لبيولوجيا الخلية الحديثة التي طورها في الأصل ألبرت كونز ، والتي تمكن من اكتشاف الجزيئات في مقصوراتها الخلوية الأصلية وتوصيف التركيبات الجزيئية للعضيات أو الآلات تحت الخلوية1. إلى جانب التلاعب الجيني ، يساعد التألق المناعي في تأسيس المفهوم المقبول الآن بأن توطين البروتين ضروري لوظيفته2. بصرف النظر عن الأجسام المضادة الأولية المحددة والأصباغ الفلورية الساطعة ، يعتمد نجاح هذه التقنية على عملية أولية تسمى التثبيت والنفاذية ، والتي تحافظ على التشكل الخلوي ، وتشل المستضدات ، وتزيد من إمكانية الوصول إلى الأجسام المضادة في المقصورات داخل الخلايا. حتما ، فإن عملية التثبيت والنفاذية ستقتل الخلايا وتنهي جميع العمليات البيولوجية3. لذلك ، يوفر التألق المناعي لقطات فقط لرحلة حياة البروتينات. ومع ذلك ، فإن العديد من العمليات البيولوجية مثل هجرة الخلايا والانقسامات ديناميكية بطبيعتها ، وتتطلب التحقيق في سلوكيات البروتين بطريقة مكانية زمانية 4,5.
لفحص ديناميات البروتين في الكائنات الحية ، تم تطوير طرق التصوير الحية القائمة على البروتينات الفلورية المشفرة وراثيا مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) 6 والمجاهر عالية السرعة متحدة البؤر. باختصار ، يمكن التلاعب بالبروتين محل الاهتمام وراثيا ليتم دمجه مع GFP7 ، ثم يتم التعبير عنه خارجيا من المروجين الفيروسي أو الخميرة مثل الفيروس المضخم للخلايا (CMV) 8 أو تسلسل التنشيط المنبع (UAS)9. نظرا لأن GFP ذاتي الفلورسنت بطبيعته ، فلا يلزم وجود أجسام مضادة مقترنة بالفلوروفور للكشف عن توطين البروتينات المستهدفة ، والتي تتجاوز ضرورة العمليات الأولية للتثبيت أو النفاذية. على مدى العقدين الماضيين ، تم تطوير علامات الفلورسنت التي تغطي الطيف الكامل للأطوال الموجية10 ، مما يتيح التصوير الحي متعدد الألوان للعديد من البروتينات المستهدفة في نفس الوقت. ومع ذلك ، بالمقارنة مع الأصباغ الفلورية المهندسة كيميائيا مثل AlexaFluor أو ATTO ، فإن التألق الذاتي لهذه البروتينات الفلورية المشفرة وراثيا ضعيف نسبيا وغير مستقر عند التعبير عنه من المروجين الداخليين ، خاصة أثناء التصوير المباشر على نطاقات زمنية أطول10. في حين يمكن التخفيف من هذا النقص عن طريق الإفراط في التعبير عن البروتينات المستهدفة الموسومة بالفلورسنت ، فإن العديد من الأنشطة الأنزيمية مثل الكينازات والفوسفاتاز تعطل بشدة العمليات البيولوجية الطبيعية إذا لم يتم التعبير عنها على المستويات الفسيولوجية.
يقدم هذا البروتوكول طريقة تتيح إضاءة الهدف القائمة على الأجسام المضادة الضوئية في إعداد صورة حية ، مما يسمح بشكل أساسي بالتألق المناعي دون عملية التثبيت أو النفاذية (الشكل 1). من خلال تفاعل أمين أولي بسيط قائم على NHS11 ، يمكن للمرء أن يقترن الأصباغ الفلورية مثل AlexaFluor 488 أو 594 مع أي جسم مضاد أولي أو GFP / HA / Myc nanobody12. بالاستفادة من ميزة تطورية تتمثل في أن جميع الخلايا الجنينية لذبابة الفاكهة تشترك في سيتوبلازم مشترك خلال المرحلة13 من المخلوي ، يمكن للمرء تحقيق ارتباط المستضد والإضاءة عبر الأجنة بأكملها بعد حقن الأجسام المضادة المترافقة بالصبغة. مع توسيع مكتبات البروتينات الموسومة داخليا المتوفرة في ذبابة الفاكهة وأنظمة النماذجالأخرى 14 ، يمكن لهذه الطريقة توسيع تطبيقات هذه المكتبات من خلال الكشف عن ديناميكيات البروتينات الموسومة بالفلورسنت منخفضة الوفرة وغيرها من البروتينات غير الموسومة بالفلورسنت (HA / Myc-tagged) في الأنسجة الحية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يحدد هذا الإجراء المقدم الطريقة المتخصصة لوضع العلامات الفلورية بالأجسام المضادة المخصصة والحقن اللاحق في أجنة ذبابة الفاكهة في المراحل المبكرة. تسهل هذه التقنية التصور في الوقت الفعلي للبروتينات أو التعديلات اللاحقة للترجمة الموجودة بكميات منخفضة والتي يصعب ملاحظتها عادة من خلا?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر الدكتورة جينيفر أ. زالن على توفير خط ذبابة الفاكهة Sqh-GFP ودعم التطوير الأولي لهذه التقنية ، والدكتور فرانسوا شويسغوث لتوفير خط ذبابة الفاكهة Notch-GFP. تم دعم هذا العمل بتمويل من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32270809) إلى H.H.Yu ، ودعم مالي سخي وموظفين من كلية علوم الحياة ، SUSTech ، وتمويل ل Y. Yan من لجنة Shenzhen للعلوم والابتكار التكنولوجي / JCYJ20200109140201722.
Materials
| Agarose | Sangon Biotech | A620014 | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20185 | Purification column from step 1.6 is included in this kit |
| Biological Microscope | SOPTOP | EX20 | Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25 |
| Bleach | Clorox® | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5245 | |
| Cell Strainer | FALCON | 352350 | |
| Desiccation chamber | LOCK&LOCK | HSM8200 | 320ml |
| Dissecting Microscope | Mshot | MZ62 | Eyepiece lens: WF10X/22mm. |
| Double-sided Tape | Scotch | 665 | |
| Fine Super Tweezer | VETUS | ST-14 | |
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545F | |
| Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Forcep | VETUS | 33A-SA | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-100ML | |
| Heptane | Sigma-Aldrich | H2198-1L | Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane |
| Dehydration reagent | TOKAI | 1-7315-01 | Fill to 90% volume of the dessication chamber |
| Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50 |
| Pneumatic picopump | World Precision Instruments | PV 830 | Eject: 20 psi; Range: 100ms; Duration: timed |
| PY20 | Santa Cruz | SC-508 | |
| Square petri dishes | Biosharp | BS-100-SD | |
| GFP nanobody | Chromotek | gt |
Riferimenti
- Coons, A. H. The beginnings of immunofluorescence. Journal of Immunology (Baltimore, Md). 87, 499-503 (1961).
- Arthur, G., et al. Harnessing the power of the antibody. The Lancet Respiratory Medicine. 4 (3), 181-182 (2016).
- Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. Biobanking, methods and protocols. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2018).
- Ragkousi, K., Gibson, M. C. Epithelial integrity and cell division: Concerted cell cycle control. Cell Cycle. 17 (4), 399-400 (2018).
- Herszterg, S., Leibfried, A., Bosveld, F., Martin, C., Bellaiche, Y. Interplay between the dividing cell and its neighbors regulates adherens junction formation during cytokinesis in epithelial tissue. Developmental Cell. 24 (3), 256-270 (2013).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, aequorea. Journal of Cellular and Comparative Physiology. 59 (3), 223-239 (1962).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Boshart, M., et al. A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus. Cell. 41 (2), 521-530 (1985).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (2), 111-129 (2016).
- Berg, E. A., Fishman, J. B. Labeling antibodies using N -Hydroxysuccinimide (NHS)-fluorescein. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (3), (2019).
- Saerens, D., et al. Identification of a universal VHH framework to graft non-canonical antigen-binding loops of camel single-domain antibodies. Journal of Molecular Biology. 352 (3), 597-607 (2005).
- Loncar, D., Singer, S. J. Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (6), 2199-2203 (1995).
- Lye, C. M., Naylor, H. W., Sanson, B. Subcellular localisations of the CPTI collection of YFP-tagged proteins in Drosophila embryos. Development. 141 (20), 4006-4017 (2014).
- Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 50, e2477 (2011).
- Figard, L., Sokac, A. M. Imaging cell shape change in living Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 49, e2503 (2011).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , 9-102 (1997).
- Ho, D. M., Artavanis-Tsakonas, S. The Notch-mediated proliferation circuitry. Current Topics in Developmental Biology. 116, 17-33 (2016).
- Kopan, R., Ilagan, X. G., Ma, The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell. 137 (2), 216-233 (2009).
- Fehon, R. G., et al. Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila. Cell. 61 (3), 523-534 (1990).
- Struhl, G., Greenwald, I. Presenilin is required for activity and nuclear access of Notch in Drosophila. Nature. 398 (6727), 522-525 (1999).
- Henrique, D., Schweisguth, F. Mechanisms of Notch signaling: a simple logic deployed in time and space. Development. 146 (3), dev172148 (2019).
- Trylinski, M., Mazouni, K., Schweisguth, F. Intra-lineage fate decisions involve of notch receptors basal to the midbody in drosophila sensory organ precursor cells. Current Biology. 27 (15), 2239.e3-2247.e3 (2017).
- Hunter, T. Protein kinases and phosphatases: The Yin and Yang of protein phosphorylation and signaling. Cell. 80 (2), 225-236 (1995).
- Glenney, J. R., Zokas, L., Kamps, M. P. Monoclonal antibodies to phosphotyrosine. Journal of Immunological Methods. 109 (2), 277-285 (1988).
- Hunter, T., Cooper, J. A. Epidermal growth factor induces rapid tyrosine phosphorylation of proteins in A431 human tumor cells. Cell. 24 (3), 741-752 (1981).
- Yu, H. H., Zallen, J. A. Abl and Canoe/Afadin mediate mechanotransduction at tricellular junctions. Science. 370 (6520), eaba5528 (2020).
- Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin–myosin network drive apical constriction. Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).
