Visualisering af proteiner med lav overflod og posttranslationelle modifikationer i levende Drosophila-embryoner via fluorescerende antistofinjektion
Summary
Denne protokol beskriver den tilpassede antistofbaserede fluorescensmærkning og injektion i tidlige Drosophila-embryoner for at muliggøre levende billeddannelse af proteiner med lav overflod eller posttranslationelle modifikationer, der er udfordrende at detektere ved hjælp af traditionelle GFP / mCherry-tag-tilgange.
Abstract
Visualisering af proteiner i levende celler ved hjælp af GFP (Green Fluorescent Protein) og andre fluorescerende tags har i høj grad forbedret forståelsen af proteinlokalisering, dynamik og funktion. Sammenlignet med immunfluorescens afspejler levende billeddannelse mere præcist proteinlokalisering uden potentielle artefakter som følge af vævsfiksering. Det er vigtigt, at levende billeddannelse muliggør kvantitativ og tidsmæssig karakterisering af proteinniveauer og lokalisering, hvilket er afgørende for at forstå dynamiske biologiske processer såsom cellebevægelse eller deling. En væsentlig begrænsning ved fluorescerende mærkningsmetoder er imidlertid behovet for tilstrækkeligt høje proteinekspressionsniveauer for at opnå vellykket visualisering. Derfor kan mange endogent mærkede fluorescerende proteiner med relativt lave ekspressionsniveauer ikke detekteres. På den anden side kan ektopisk ekspression ved hjælp af virale promotorer undertiden føre til proteinfejllokalisering eller funktionelle ændringer i fysiologiske sammenhænge. For at løse disse begrænsninger præsenteres en tilgang, der anvender meget følsom antistofmedieret proteindetektion i levende embryoner, der i det væsentlige udfører immunfluorescens uden behov for vævsfiksering. Som bevis på princippet kan endogent GFP-mærket Notch-receptor, der næppe kan påvises i levende embryoner, visualiseres med succes efter antistofinjektion. Desuden blev denne tilgang tilpasset til at visualisere posttranslationelle modifikationer (PTM’er) i levende embryoner, hvilket muliggør påvisning af tidsmæssige ændringer i tyrosinphosphoryleringsmønstre under tidlig embryogenese og afslører en ny subpopulation af phosphotyrosin (p-Tyr) under apikale membraner. Denne fremgangsmåde kan modificeres til at rumme andre proteinspecifikke, mærkespecifikke eller PTM-specifikke antistoffer og bør være kompatibel med andre injektionsmodtagelige modelorganismer eller cellelinjer. Denne protokol åbner nye muligheder for levende billeddannelse af proteiner eller PTM’er med lav forekomst, der tidligere var udfordrende at detektere ved hjælp af traditionelle fluorescerende mærkningsmetoder.
Introduction
Immunofluorescens er en hjørnestensteknik i moderne cellebiologi, der oprindeligt blev udviklet af Albert Coons, som muliggør påvisning af molekyler i deres oprindelige cellulære rum og karakterisering af de molekylære sammensætninger af subcellulære organeller eller maskiner1. Sammen med genetiske manipulationer hjælper immunofluorescens med at etablere det nu velaccepterede koncept, at proteinlokalisering er afgørende for dets funktion2. Bortset fra specifikke primære antistoffer og lyse fluorescerende farvestoffer afhænger succesen med denne teknik af en foreløbig proces kaldet fiksering og permeabilisering, som bevarer cellulære morfologier, immobiliserer antigener og øger tilgængeligheden af antistoffer i intracellulære rum. Uundgåeligt ville fikserings- og permeabiliseringsprocessen dræbe celler og afslutte alle biologiske processer3. Derfor giver immunofluorescens kun snapshots af proteiners livsrejse. Imidlertid er mange biologiske processer såsom cellemigration og delinger dynamiske, hvilket kræver undersøgelse af proteinadfærd på en rumlig-tidsmæssigt løst måde 4,5.
For at undersøge proteindynamikken i levende organismer er der udviklet levende billeddannelsesmetoder baseret på genetisk kodede fluorescerende proteiner såsom grønt fluorescerende protein (GFP)6 og højhastighedskonfokale mikroskoper. Kort fortalt kan proteinet af interesse genetisk manipuleres til at blive smeltet sammen med GFP7 og derefter ektopisk udtrykt fra virale eller gærpromotorer såsom cytomegalovirus (CMV)8 eller opstrøms aktiveringssekvens (UAS)9. Fordi GFP er autofluorescerende i naturen, kræves der ingen fluoroforkoblede antistoffer for at afsløre lokaliseringen af målproteiner, hvilket omgår nødvendigheden af indledende fikseringsprocesser eller permeabilisering. I løbet af de sidste to årtier er fluorescerende mærker, der spænder over hele spektret af bølgelængder, blevet udviklet10, hvilket muliggør flerfarvet levende billeddannelse af flere målproteiner på samme tid. Sammenlignet med kemisk manipulerede fluorescerende farvestoffer som AlexaFluor eller ATTO er autofluorescensen af disse genetisk kodede fluorescerende proteiner imidlertid relativt svag og ustabil, når den udtrykkes fra endogene promotorer, især under levende billeddannelse over længere tidsskalaer10. Mens denne mangel kan afbødes ved overekspression af fluorescerende mærkede målproteiner, forstyrrer mange med enzymatiske aktiviteter såsom kinaser og fosfataser alvorligt normale biologiske processer, hvis de ikke udtrykkes på fysiologiske niveauer.
Denne protokol præsenterer en metode, der muliggør fototabel antistofbaseret målbelysning i en live billedopsætning, hvilket i det væsentlige tillader immunofluorescens uden fikserings- eller permeabiliseringsprocessen (figur 1). Gennem en simpel NHS-baseret primær aminreaktion11 kan man konjugere fluorescerende farvestoffer som AlexaFluor 488 eller 594 med stort set ethvert primært antistof eller GFP / HA / Myc nanobody12. Ved at udnytte en udviklingsfunktion, at alle Drosophila embryonale celler deler en fælles cytoplasma under syncytium fase13, kan man opnå antigenbinding og belysning på tværs af hele embryoner efter injektion af farvestofkonjugerede antistoffer. Med ekspanderende biblioteker af endogent mærkede proteiner, der er tilgængelige i Drosophila og andre modelsystemer14, kan denne metode potentielt udvide anvendelser af disse biblioteker ved at afsløre dynamikken i fluorescerende mærkede proteiner med lav overflod og andre ikke-fluorescerende mærkede (HA / Myc-mærkede) proteiner i levende væv.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne præsenterede procedure skitserer den specialiserede metode til fluorescensmærkning med brugerdefinerede antistoffer og efterfølgende injektion i tidlige stadier af Drosophila-embryoner . Denne teknik letter visualisering i realtid af proteiner eller posttranslationelle modifikationer, der findes i lave mængder og typisk er vanskelige at observere gennem konventionelle GFP / mCherry-mærkningsmetoder.
Der bør udvises forsigtighed, når denne metode udvides til at omfatte kva…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Dr. Jennifer A. Zallen for at levere Sqh-GFP Drosophila-linjen og støtte til den indledende udvikling af denne teknik og Dr. Francois Schweisguth for at levere Notch-GFP Drosophila-linjen . Dette arbejde blev støttet af finansiering fra National Natural Science Foundation of China (32270809) til HH Yu, generøs økonomisk og personalestøtte fra School of Life Sciences, SUSTech og finansiering til Y. Yan fra Shenzhen Science and Technology Innovation Commission / JCYJ20200109140201722.
Materials
| Agarose | Sangon Biotech | A620014 | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20185 | Purification column from step 1.6 is included in this kit |
| Biological Microscope | SOPTOP | EX20 | Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25 |
| Bleach | Clorox® | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5245 | |
| Cell Strainer | FALCON | 352350 | |
| Desiccation chamber | LOCK&LOCK | HSM8200 | 320ml |
| Dissecting Microscope | Mshot | MZ62 | Eyepiece lens: WF10X/22mm. |
| Double-sided Tape | Scotch | 665 | |
| Fine Super Tweezer | VETUS | ST-14 | |
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545F | |
| Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Forcep | VETUS | 33A-SA | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-100ML | |
| Heptane | Sigma-Aldrich | H2198-1L | Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane |
| Dehydration reagent | TOKAI | 1-7315-01 | Fill to 90% volume of the dessication chamber |
| Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50 |
| Pneumatic picopump | World Precision Instruments | PV 830 | Eject: 20 psi; Range: 100ms; Duration: timed |
| PY20 | Santa Cruz | SC-508 | |
| Square petri dishes | Biosharp | BS-100-SD | |
| GFP nanobody | Chromotek | gt |
Riferimenti
- Coons, A. H. The beginnings of immunofluorescence. Journal of Immunology (Baltimore, Md). 87, 499-503 (1961).
- Arthur, G., et al. Harnessing the power of the antibody. The Lancet Respiratory Medicine. 4 (3), 181-182 (2016).
- Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. Biobanking, methods and protocols. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2018).
- Ragkousi, K., Gibson, M. C. Epithelial integrity and cell division: Concerted cell cycle control. Cell Cycle. 17 (4), 399-400 (2018).
- Herszterg, S., Leibfried, A., Bosveld, F., Martin, C., Bellaiche, Y. Interplay between the dividing cell and its neighbors regulates adherens junction formation during cytokinesis in epithelial tissue. Developmental Cell. 24 (3), 256-270 (2013).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, aequorea. Journal of Cellular and Comparative Physiology. 59 (3), 223-239 (1962).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Boshart, M., et al. A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus. Cell. 41 (2), 521-530 (1985).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (2), 111-129 (2016).
- Berg, E. A., Fishman, J. B. Labeling antibodies using N -Hydroxysuccinimide (NHS)-fluorescein. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (3), (2019).
- Saerens, D., et al. Identification of a universal VHH framework to graft non-canonical antigen-binding loops of camel single-domain antibodies. Journal of Molecular Biology. 352 (3), 597-607 (2005).
- Loncar, D., Singer, S. J. Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (6), 2199-2203 (1995).
- Lye, C. M., Naylor, H. W., Sanson, B. Subcellular localisations of the CPTI collection of YFP-tagged proteins in Drosophila embryos. Development. 141 (20), 4006-4017 (2014).
- Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 50, e2477 (2011).
- Figard, L., Sokac, A. M. Imaging cell shape change in living Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 49, e2503 (2011).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , 9-102 (1997).
- Ho, D. M., Artavanis-Tsakonas, S. The Notch-mediated proliferation circuitry. Current Topics in Developmental Biology. 116, 17-33 (2016).
- Kopan, R., Ilagan, X. G., Ma, The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell. 137 (2), 216-233 (2009).
- Fehon, R. G., et al. Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila. Cell. 61 (3), 523-534 (1990).
- Struhl, G., Greenwald, I. Presenilin is required for activity and nuclear access of Notch in Drosophila. Nature. 398 (6727), 522-525 (1999).
- Henrique, D., Schweisguth, F. Mechanisms of Notch signaling: a simple logic deployed in time and space. Development. 146 (3), dev172148 (2019).
- Trylinski, M., Mazouni, K., Schweisguth, F. Intra-lineage fate decisions involve of notch receptors basal to the midbody in drosophila sensory organ precursor cells. Current Biology. 27 (15), 2239.e3-2247.e3 (2017).
- Hunter, T. Protein kinases and phosphatases: The Yin and Yang of protein phosphorylation and signaling. Cell. 80 (2), 225-236 (1995).
- Glenney, J. R., Zokas, L., Kamps, M. P. Monoclonal antibodies to phosphotyrosine. Journal of Immunological Methods. 109 (2), 277-285 (1988).
- Hunter, T., Cooper, J. A. Epidermal growth factor induces rapid tyrosine phosphorylation of proteins in A431 human tumor cells. Cell. 24 (3), 741-752 (1981).
- Yu, H. H., Zallen, J. A. Abl and Canoe/Afadin mediate mechanotransduction at tricellular junctions. Science. 370 (6520), eaba5528 (2020).
- Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin–myosin network drive apical constriction. Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).
