Visualisering av proteiner med låg förekomst och posttranslationella modifieringar i levande Drosophila-embryon via injektion av fluorescerande antikroppar
Summary
Detta protokoll beskriver den skräddarsydda antikroppsbaserade fluorescensmärkningen och injektionen i tidiga Drosophila-embryon för att möjliggöra levande avbildning av proteiner med låg förekomst eller posttranslationella modifieringar som är utmanande att upptäcka med traditionella GFP/mCherry-tag-metoder.
Abstract
Visualisering av proteiner i levande celler med hjälp av GFP (Green Fluorescent Protein) och andra fluorescerande taggar har avsevärt förbättrat förståelsen för proteinlokalisering, dynamik och funktion. Jämfört med immunofluorescens återspeglar live-avbildning mer exakt proteinlokalisering utan potentiella artefakter som uppstår vid vävnadsfixering. Viktigt är att live-avbildning möjliggör kvantitativ och tidsmässig karakterisering av proteinnivåer och lokalisering, vilket är avgörande för att förstå dynamiska biologiska processer som cellrörelse eller celldelning. En stor begränsning för fluorescerande märkningsmetoder är dock behovet av tillräckligt höga proteinuttrycksnivåer för att uppnå framgångsrik visualisering. Följaktligen kan många endogent märkta fluorescerande proteiner med relativt låga uttrycksnivåer inte detekteras. Å andra sidan kan ektopiskt uttryck med hjälp av virala promotorer ibland leda till fellokalisering av proteiner eller funktionella förändringar i fysiologiska sammanhang. För att ta itu med dessa begränsningar presenteras ett tillvägagångssätt som använder mycket känslig antikroppsmedierad proteindetektion i levande embryon, vilket i huvudsak utför immunofluorescens utan behov av vävnadsfixering. Som principbevis kan endogent GFP-märkt Notch-receptor som knappt är detekterbar i levande embryon framgångsrikt visualiseras efter antikroppsinjektion. Dessutom anpassades detta tillvägagångssätt för att visualisera posttranslationella modifieringar (PTM) i levande embryon, vilket gör det möjligt att upptäcka tidsmässiga förändringar i tyrosinfosforyleringsmönster under tidig embryogenes och avslöja en ny subpopulation av fosfotyrosin (p-Tyr) under apikala membran. Detta tillvägagångssätt kan modifieras för att rymma andra proteinspecifika, taggspecifika eller PTM-specifika antikroppar och bör vara kompatibelt med andra injektionsvänliga modellorganismer eller cellinjer. Detta protokoll öppnar nya möjligheter för live-avbildning av proteiner med låg förekomst eller PTM:er som tidigare var utmanande att upptäcka med traditionella fluorescerande märkningsmetoder.
Introduction
Immunofluorescens är en hörnstensteknik i modern cellbiologi som ursprungligen utvecklades av Albert Coons, som möjliggör detektion av molekyler vid deras ursprungliga cellulära fack och karakterisering av de molekylära sammansättningarna av subcellulära organeller eller maskineri1. Tillsammans med genetiska manipulationer hjälper immunofluorescens till att etablera det nu väl accepterade konceptet att proteinlokalisering är avgörande för dess funktion2. Bortsett från specifika primära antikroppar och ljusa fluorescerande färgämnen, beror framgången för denna teknik på en preliminär process som kallas fixering och permeabilisering, som bevarar cellulära morfologier, immobiliserar antigener och ökar tillgängligheten av antikroppar i intracellulära fack. Oundvikligen skulle fixerings- och permeabiliseringsprocessen döda celler och avsluta alla biologiska processer3. Därför ger immunofluorescens bara ögonblicksbilder av proteiners livsresa. Många biologiska processer, såsom cellmigration och celldelning, är dock dynamiska till sin natur, vilket kräver undersökning av proteinbeteenden på ett rumsligt-tidsmässigt upplöst sätt 4,5.
För att undersöka proteindynamik i levande organismer har levande avbildningsmetoder baserade på genetiskt kodade fluorescerande proteiner såsom grönt fluorescerande protein (GFP)6 och höghastighetskonfokalmikroskop utvecklats. Kortfattat kan proteinet av intresse manipuleras genetiskt för att smältas samman med GFP7 och sedan uttryckas ektopiskt från virus- eller jästpromotorer såsom cytomegalovirus (CMV)8 eller uppströms aktiveringssekvens (UAS)9. Eftersom GFP är autofluorescerande till sin natur krävs inga fluoroforkopplade antikroppar för att avslöja lokaliseringen av målproteiner, vilket kringgår behovet av preliminära processer för fixering eller permeabilisering. Under de senaste två decennierna har fluorescerande taggar som spänner över hela spektrumet av våglängder utvecklats10, vilket möjliggör flerfärgad live-avbildning av flera målproteiner samtidigt. Jämfört med kemiskt framställda fluorescerande färgämnen som AlexaFluor eller ATTO är dock autofluorescensen hos dessa genetiskt kodade fluorescerande proteiner relativt svag och instabil när den uttrycks från endogena promotorer, särskilt under live-avbildning över längre tidsskalor10. Även om denna brist kan mildras genom överuttryck av fluorescerande märkta målproteiner, stör många med enzymatisk aktivitet såsom kinaser och fosfataser allvarligt normala biologiska processer om de inte uttrycks på fysiologiska nivåer.
Detta protokoll presenterar en metod som möjliggör fotostabil antikroppsbaserad målbelysning i en livebildsuppställning, vilket i huvudsak möjliggör immunofluorescens utan fixering eller permeabilisering (figur 1). Genom en enkel NHS-baserad primär aminreaktion11 kan man konjugera fluorescerande färgämnen som AlexaFluor 488 eller 594 med i stort sett vilken primär antikropp som helst eller GFP/HA/Myc nanobody12. Genom att dra nytta av en utvecklingsegenskap att alla Drosophila-embryonala celler delar en gemensam cytoplasma under syncytiumstadium13, kan man uppnå antigenbindning och belysning över hela embryon efter injektion av färgkonjugerade antikroppar. Med växande bibliotek av endogent märkta proteiner tillgängliga i Drosophila och andra modellsystem14, kan denna metod potentiellt bredda tillämpningarna av dessa bibliotek genom att avslöja dynamiken hos fluorescerande märkta proteiner med låg förekomst och andra icke-fluorescerande märkta (HA/Myc-märkta) proteiner i levande vävnader.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna presenterade procedur beskriver den specialiserade metoden för fluorescensmärkning med anpassade antikroppar och efterföljande injektion i tidiga stadier av Drosophila-embryon . Denna teknik underlättar visualisering i realtid av proteiner eller posttranslationella modifieringar som finns i små mängder och som vanligtvis är svåra att observera genom konventionella GFP/mCherry-märkningsmetoder.
Försiktighet bör iakttas när denna metod utvidgas till att omfatta kvantit…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Dr. Jennifer A. Zallen för att ha tillhandahållit Sqh-GFP Drosophila-linjen och stöd för den initiala utvecklingen av denna teknik, och Dr. Francois Schweisguth för att ha tillhandahållit Notch-GFP Drosophila-linjen . Detta arbete stöddes av finansiering från National Natural Science Foundation of China (32270809) till H.H.Yu, generöst ekonomiskt och personalstöd från School of Life Sciences, SUSTech, och finansiering till Y. Yan från Shenzhen Science and Technology Innovation Commission/JCYJ20200109140201722.
Materials
| Agarose | Sangon Biotech | A620014 | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20185 | Purification column from step 1.6 is included in this kit |
| Biological Microscope | SOPTOP | EX20 | Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25 |
| Bleach | Clorox® | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5245 | |
| Cell Strainer | FALCON | 352350 | |
| Desiccation chamber | LOCK&LOCK | HSM8200 | 320ml |
| Dissecting Microscope | Mshot | MZ62 | Eyepiece lens: WF10X/22mm. |
| Double-sided Tape | Scotch | 665 | |
| Fine Super Tweezer | VETUS | ST-14 | |
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545F | |
| Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Forcep | VETUS | 33A-SA | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-100ML | |
| Heptane | Sigma-Aldrich | H2198-1L | Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane |
| Dehydration reagent | TOKAI | 1-7315-01 | Fill to 90% volume of the dessication chamber |
| Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50 |
| Pneumatic picopump | World Precision Instruments | PV 830 | Eject: 20 psi; Range: 100ms; Duration: timed |
| PY20 | Santa Cruz | SC-508 | |
| Square petri dishes | Biosharp | BS-100-SD | |
| GFP nanobody | Chromotek | gt |
Riferimenti
- Coons, A. H. The beginnings of immunofluorescence. Journal of Immunology (Baltimore, Md). 87, 499-503 (1961).
- Arthur, G., et al. Harnessing the power of the antibody. The Lancet Respiratory Medicine. 4 (3), 181-182 (2016).
- Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. Biobanking, methods and protocols. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2018).
- Ragkousi, K., Gibson, M. C. Epithelial integrity and cell division: Concerted cell cycle control. Cell Cycle. 17 (4), 399-400 (2018).
- Herszterg, S., Leibfried, A., Bosveld, F., Martin, C., Bellaiche, Y. Interplay between the dividing cell and its neighbors regulates adherens junction formation during cytokinesis in epithelial tissue. Developmental Cell. 24 (3), 256-270 (2013).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, aequorea. Journal of Cellular and Comparative Physiology. 59 (3), 223-239 (1962).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Boshart, M., et al. A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus. Cell. 41 (2), 521-530 (1985).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (2), 111-129 (2016).
- Berg, E. A., Fishman, J. B. Labeling antibodies using N -Hydroxysuccinimide (NHS)-fluorescein. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (3), (2019).
- Saerens, D., et al. Identification of a universal VHH framework to graft non-canonical antigen-binding loops of camel single-domain antibodies. Journal of Molecular Biology. 352 (3), 597-607 (2005).
- Loncar, D., Singer, S. J. Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (6), 2199-2203 (1995).
- Lye, C. M., Naylor, H. W., Sanson, B. Subcellular localisations of the CPTI collection of YFP-tagged proteins in Drosophila embryos. Development. 141 (20), 4006-4017 (2014).
- Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 50, e2477 (2011).
- Figard, L., Sokac, A. M. Imaging cell shape change in living Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 49, e2503 (2011).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , 9-102 (1997).
- Ho, D. M., Artavanis-Tsakonas, S. The Notch-mediated proliferation circuitry. Current Topics in Developmental Biology. 116, 17-33 (2016).
- Kopan, R., Ilagan, X. G., Ma, The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell. 137 (2), 216-233 (2009).
- Fehon, R. G., et al. Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila. Cell. 61 (3), 523-534 (1990).
- Struhl, G., Greenwald, I. Presenilin is required for activity and nuclear access of Notch in Drosophila. Nature. 398 (6727), 522-525 (1999).
- Henrique, D., Schweisguth, F. Mechanisms of Notch signaling: a simple logic deployed in time and space. Development. 146 (3), dev172148 (2019).
- Trylinski, M., Mazouni, K., Schweisguth, F. Intra-lineage fate decisions involve of notch receptors basal to the midbody in drosophila sensory organ precursor cells. Current Biology. 27 (15), 2239.e3-2247.e3 (2017).
- Hunter, T. Protein kinases and phosphatases: The Yin and Yang of protein phosphorylation and signaling. Cell. 80 (2), 225-236 (1995).
- Glenney, J. R., Zokas, L., Kamps, M. P. Monoclonal antibodies to phosphotyrosine. Journal of Immunological Methods. 109 (2), 277-285 (1988).
- Hunter, T., Cooper, J. A. Epidermal growth factor induces rapid tyrosine phosphorylation of proteins in A431 human tumor cells. Cell. 24 (3), 741-752 (1981).
- Yu, H. H., Zallen, J. A. Abl and Canoe/Afadin mediate mechanotransduction at tricellular junctions. Science. 370 (6520), eaba5528 (2020).
- Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin–myosin network drive apical constriction. Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).
