Floresan Antikor Enjeksiyonu ile Canlı Drosophila Embriyolarında Düşük Bolluktaki Proteinlerin ve Translasyon Sonrası Modifikasyonların Görselleştirilmesi
Summary
Bu protokol, geleneksel GFP/mCherry etiketi yaklaşımları kullanılarak tespit edilmesi zor olan düşük bolluktaki proteinlerin veya translasyon sonrası modifikasyonların canlı görüntülenmesini sağlamak için özelleştirilmiş antikor bazlı floresan etiketlemeyi ve erken Drosophila embriyolarına enjeksiyonu açıklar.
Abstract
GFP (Yeşil Floresan Protein) ve diğer floresan etiketler kullanılarak canlı hücrelerdeki proteinlerin görselleştirilmesi, protein lokalizasyonu, dinamikleri ve işlevinin anlaşılmasını büyük ölçüde geliştirmiştir. İmmünofloresan ile karşılaştırıldığında, canlı görüntüleme, doku fiksasyonundan kaynaklanan potansiyel artefaktlar olmadan protein lokalizasyonunu daha doğru bir şekilde yansıtır. Daha da önemlisi, canlı görüntüleme, hücre hareketi veya bölünmesi gibi dinamik biyolojik süreçleri anlamak için çok önemli olan protein seviyelerinin ve lokalizasyonunun nicel ve zamansal karakterizasyonunu sağlar. Bununla birlikte, floresan etiketleme yaklaşımlarının önemli bir sınırlaması, başarılı görselleştirme elde etmek için yeterince yüksek protein ekspresyon seviyelerine duyulan ihtiyaçtır. Sonuç olarak, nispeten düşük ekspresyon seviyelerine sahip birçok endojen etiketli floresan proteini tespit edilemez. Öte yandan, viral promotörler kullanılarak ektopik ekspresyon bazen fizyolojik bağlamlarda protein yanlış lokalizasyonuna veya fonksiyonel değişikliklere yol açabilir. Bu sınırlamaları ele almak için, canlı embriyolarda oldukça hassas antikor aracılı protein tespitini kullanan, esasen doku fiksasyonuna gerek kalmadan immünofloresan gerçekleştiren bir yaklaşım sunulmaktadır. Prensip kanıtı olarak, canlı embriyolarda zar zor tespit edilebilen endojen GFP etiketli Notch reseptörü, antikor enjeksiyonundan sonra başarılı bir şekilde görselleştirilebilir. Ayrıca, bu yaklaşım, canlı embriyolarda translasyon sonrası modifikasyonları (PTM’ler) görselleştirmek için uyarlandı, erken embriyogenez sırasında tirozin fosforilasyon modellerindeki zamansal değişikliklerin saptanmasına izin verdi ve apikal membranların altında yeni bir fosfotirozin (p-Tyr) alt popülasyonunu ortaya çıkardı. Bu yaklaşım, diğer proteine özgü, etikete özgü veya PTM’ye özgü antikorları barındıracak şekilde değiştirilebilir ve diğer enjeksiyona uygun model organizmalar veya hücre dizileri ile uyumlu olmalıdır. Bu protokol, daha önce geleneksel floresan etiketleme yöntemleri kullanılarak tespit edilmesi zor olan düşük bolluktaki proteinlerin veya PTM’lerin canlı görüntülenmesi için yeni olanaklar sunar.
Introduction
İmmünofloresan, orijinal olarak Albert Coons tarafından geliştirilen, moleküllerin doğal hücresel bölmelerinde saptanmasını ve hücre altı organellerin veya makinelerin moleküler bileşimlerinin karakterizasyonunu sağlayan modern hücre biyolojisinin temel taşı tekniğidir1. Genetik manipülasyonlarla birleştiğinde, immünofloresan, protein lokalizasyonunun işlevi için gerekli olduğu konusunda artık iyi kabul edilen kavramın oluşturulmasına yardımcı olur2. Spesifik primer antikorlar ve parlak floresan boyaların yanı sıra, bu tekniğin başarısı, hücresel morfolojileri koruyan, antijenleri hareketsiz hale getiren ve antikorların hücre içi bölmelere erişilebilirliğini artıran fiksasyon ve geçirgenleştirme adı verilen bir ön işleme dayanır. Kaçınılmaz olarak, fiksasyon ve geçirgenleştirme süreci hücreleri öldürecek ve tüm biyolojik süreçleri sonlandıracaktır3. Bu nedenle, immünofloresan sadece proteinlerin yaşam yolculuğunun anlık görüntülerini sağlar. Bununla birlikte, hücre göçü ve bölünmeleri gibi birçok biyolojik süreç, doğası gereği dinamiktir ve protein davranışlarının mekansal-zamansal olarak çözülmüş bir şekilde araştırılmasını gerektirir 4,5.
Canlı organizmalardaki protein dinamiklerini incelemek için, yeşil floresan proteini (GFP)6 gibi genetik olarak kodlanmış floresan proteinlere ve yüksek hızlı konfokal mikroskoplara dayalı canlı görüntüleme yöntemleri geliştirilmiştir. Kısaca, ilgilenilen protein, GFP7 ile kaynaştırılmak üzere genetik olarak manipüle edilebilir ve daha sonra sitomegalovirüs (CMV)8 veya yukarı akış aktivasyon dizisi (UAS)9 gibi viral veya maya promotörlerinden ektopik olarak eksprese edilebilir. GFP doğası gereği otofloresan olduğundan, hedef proteinlerin lokalizasyonunu ortaya çıkarmak için florofora bağlı antikorlara gerek yoktur, bu da fiksasyon veya geçirgenleştirme ön işlemlerinin gerekliliğini atlar. Son yirmi yılda, dalga boyunun tüm spektrumunu kapsayan floresan etiketlergeliştirildi 10 ve aynı anda birkaç hedef proteinin çok renkli canlı görüntülenmesini sağladı. Bununla birlikte, AlexaFluor veya ATTO gibi kimyasal olarak tasarlanmış floresan boyalarla karşılaştırıldığında, bu genetik olarak kodlanmış floresan proteinlerin otofloresansı, özellikle daha uzun zaman ölçeklerinde canlı görüntüleme sırasında, endojen promotörlerden eksprese edildiğinde nispeten zayıf ve kararsızdır10. Bu eksiklik, floresan etiketli hedef proteinlerin aşırı eksprese edilmesiyle hafifletilebilirken, kinazlar ve fosfatazlar gibi enzimatik aktivitelere sahip birçoğu, fizyolojik seviyelerde eksprese edilmezse normal biyolojik süreçleri ciddi şekilde bozar.
Bu protokol, canlı bir görüntü kurulumunda fotostabil antikor tabanlı hedef aydınlatmayı mümkün kılan, esasen fiksasyon veya geçirgenleştirme işlemi olmadan immünofloresansa izin veren bir yöntem sunar (Şekil 1). Basit bir NHS bazlı birincil amin reaksiyonu11 yoluyla, AlexaFluor 488 veya 594 gibi floresan boyalar, esasen herhangi bir birincil antikor veya GFP / HA / Myc nanokor12 ile konjuge edilebilir. Tüm Drosophila embriyonik hücrelerinin sinsityum evre13 sırasında ortak bir sitoplazmayı paylaştığı gelişimsel bir özellikten yararlanarak, boya konjuge antikorların enjeksiyonundan sonra tüm embriyolar boyunca antijen bağlanması ve aydınlanması sağlanabilir. Drosophila ve diğer model sistemlerde14 bulunan endojen olarak etiketlenmiş proteinlerin genişleyen kütüphaneleri ile bu yöntem, canlı dokulardaki düşük bollukta floresan etiketli proteinlerin ve diğer floresan etiketli olmayan (HA / Myc etiketli) proteinlerin dinamiklerini ortaya çıkararak bu kütüphanelerin uygulamalarını potansiyel olarak genişletebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sunulan bu prosedür, özel antikorlarla özel floresan etiketleme yöntemini ve ardından erken evre Drosophila embriyolarına enjeksiyonu özetlemektedir. Bu teknik, düşük miktarlarda bulunan ve tipik olarak geleneksel GFP/mCherry etiketleme yöntemleriyle gözlemlenmesi zor olan proteinlerin veya translasyon sonrası modifikasyonların gerçek zamanlı görselleştirilmesini kolaylaştırır.
Yabani tip ve mutant embriyolar arasında kantitatif karşılaştırmalar yapmak için …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Jennifer A. Zallen’e Sqh-GFP Drosophila serisini sağladığı ve bu tekniğin ilk gelişimine destek verdiği için ve Dr. Francois Schweisguth’a Notch-GFP Drosophila serisini sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı’ndan (32270809) H.H.Yu’ya, Yaşam Bilimleri Okulu, SUSTech’ten cömert mali ve personel desteği ve Shenzhen Bilim ve Teknoloji İnovasyon Komisyonu/JCYJ20200109140201722’dan Y. Yan’a sağlanan finansmanla desteklenmiştir.
Materials
| Agarose | Sangon Biotech | A620014 | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20185 | Purification column from step 1.6 is included in this kit |
| Biological Microscope | SOPTOP | EX20 | Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25 |
| Bleach | Clorox® | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5245 | |
| Cell Strainer | FALCON | 352350 | |
| Desiccation chamber | LOCK&LOCK | HSM8200 | 320ml |
| Dissecting Microscope | Mshot | MZ62 | Eyepiece lens: WF10X/22mm. |
| Double-sided Tape | Scotch | 665 | |
| Fine Super Tweezer | VETUS | ST-14 | |
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545F | |
| Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Forcep | VETUS | 33A-SA | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-100ML | |
| Heptane | Sigma-Aldrich | H2198-1L | Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane |
| Dehydration reagent | TOKAI | 1-7315-01 | Fill to 90% volume of the dessication chamber |
| Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50 |
| Pneumatic picopump | World Precision Instruments | PV 830 | Eject: 20 psi; Range: 100ms; Duration: timed |
| PY20 | Santa Cruz | SC-508 | |
| Square petri dishes | Biosharp | BS-100-SD | |
| GFP nanobody | Chromotek | gt |
Riferimenti
- Coons, A. H. The beginnings of immunofluorescence. Journal of Immunology (Baltimore, Md). 87, 499-503 (1961).
- Arthur, G., et al. Harnessing the power of the antibody. The Lancet Respiratory Medicine. 4 (3), 181-182 (2016).
- Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. Biobanking, methods and protocols. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2018).
- Ragkousi, K., Gibson, M. C. Epithelial integrity and cell division: Concerted cell cycle control. Cell Cycle. 17 (4), 399-400 (2018).
- Herszterg, S., Leibfried, A., Bosveld, F., Martin, C., Bellaiche, Y. Interplay between the dividing cell and its neighbors regulates adherens junction formation during cytokinesis in epithelial tissue. Developmental Cell. 24 (3), 256-270 (2013).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, aequorea. Journal of Cellular and Comparative Physiology. 59 (3), 223-239 (1962).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Boshart, M., et al. A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus. Cell. 41 (2), 521-530 (1985).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (2), 111-129 (2016).
- Berg, E. A., Fishman, J. B. Labeling antibodies using N -Hydroxysuccinimide (NHS)-fluorescein. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (3), (2019).
- Saerens, D., et al. Identification of a universal VHH framework to graft non-canonical antigen-binding loops of camel single-domain antibodies. Journal of Molecular Biology. 352 (3), 597-607 (2005).
- Loncar, D., Singer, S. J. Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (6), 2199-2203 (1995).
- Lye, C. M., Naylor, H. W., Sanson, B. Subcellular localisations of the CPTI collection of YFP-tagged proteins in Drosophila embryos. Development. 141 (20), 4006-4017 (2014).
- Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 50, e2477 (2011).
- Figard, L., Sokac, A. M. Imaging cell shape change in living Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 49, e2503 (2011).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , 9-102 (1997).
- Ho, D. M., Artavanis-Tsakonas, S. The Notch-mediated proliferation circuitry. Current Topics in Developmental Biology. 116, 17-33 (2016).
- Kopan, R., Ilagan, X. G., Ma, The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell. 137 (2), 216-233 (2009).
- Fehon, R. G., et al. Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila. Cell. 61 (3), 523-534 (1990).
- Struhl, G., Greenwald, I. Presenilin is required for activity and nuclear access of Notch in Drosophila. Nature. 398 (6727), 522-525 (1999).
- Henrique, D., Schweisguth, F. Mechanisms of Notch signaling: a simple logic deployed in time and space. Development. 146 (3), dev172148 (2019).
- Trylinski, M., Mazouni, K., Schweisguth, F. Intra-lineage fate decisions involve of notch receptors basal to the midbody in drosophila sensory organ precursor cells. Current Biology. 27 (15), 2239.e3-2247.e3 (2017).
- Hunter, T. Protein kinases and phosphatases: The Yin and Yang of protein phosphorylation and signaling. Cell. 80 (2), 225-236 (1995).
- Glenney, J. R., Zokas, L., Kamps, M. P. Monoclonal antibodies to phosphotyrosine. Journal of Immunological Methods. 109 (2), 277-285 (1988).
- Hunter, T., Cooper, J. A. Epidermal growth factor induces rapid tyrosine phosphorylation of proteins in A431 human tumor cells. Cell. 24 (3), 741-752 (1981).
- Yu, H. H., Zallen, J. A. Abl and Canoe/Afadin mediate mechanotransduction at tricellular junctions. Science. 370 (6520), eaba5528 (2020).
- Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin–myosin network drive apical constriction. Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).
