In questo articolo, descriviamo uno strumento avanzato progettato per il monitoraggio della biosintesi della clorofilla durante le prime fasi di de-eziolamento delle piantine di Arabidopsis . La nuova metodologia fornisce immagini non invasive in tempo reale della fluorescenza della clorofilla ad alta risoluzione spaziale e temporale.
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Articolo metodologico
Test non invasivo per la determinazione della cinetica della biosintesi della clorofilla durante le prime fasi della deeziolazione dell'Arabidopsis
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La biosintesi della clorofilla è un segno distintivo della deeziolazione, una delle fasi più drammatiche del ciclo di vita delle piante. Il processo strettamente controllato e altamente dinamico della biosintesi della clorofilla viene innescato durante il passaggio dal buio alla luce nelle piante da fiore. Nel momento in cui le piantine eziolate sono esposte alle prime tracce di luce solare, la rapida (in ordine di secondi) conversione della protoclorofilla in clorofilla è mediata da complessi proteici unici che accettano la luce, portando attraverso le successive fasi metaboliche alla produzione di clorofilla completamente funzionale. Le tecniche standard per l'analisi del contenuto di clorofilla includono l'estrazione di pigmenti da tessuti vegetali distaccati, che non si applica allo studio di processi così veloci. Per studiare la cinetica della clorofilla in vivo con elevata precisione e risoluzione spazio-temporale nelle prime ore dopo la de-eziolazione indotta dalla luce, sono stati sviluppati uno strumento e un protocollo. Qui, presentiamo una procedura dettagliata progettata per una quantificazione statisticamente robusta della clorofilla nelle prime fasi della deeziolazione di Arabidopsis .
Introduzione
La deeziolazione rappresenta la fase più drammatica del ciclo vitale della pianta, caratterizzata da una serie di cambiamenti morfologici e da un completo riarrangiamento del metabolismo della pianta (da etero- ad auto-tropico)1. La biosintesi della clorofilla è un segno distintivo della deeziolazione indotta dalla luce nelle piante e un processo molto dinamico. La formazione di clorofilla dai precursori protoclorofillidi prodotti dall'oscurità deve essere strettamente coordinata per evitare danni dovuti a sottoprodotti reattivi2. La riduzione della protoclorofillide a clorofillide è catalizzata dalle protoclorofillide o....
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Protocollo
1. Preparazione media
- Preparare il terreno di coltura mescolando 0,75 g di gelificante con 50 ml di acqua deionizzata sterile in un flacone di vetro per ottenere una concentrazione dell'1,5% (p/v) per una piastra di Petri (120 x 120 x 17 mm). Agitare delicatamente la miscela e poi riscaldarla nel microonde fino all'ebollizione per sciogliere il gelificante (la soluzione diventa limpida).
- Lasciare raffreddare il terreno a 58-60 °C prima di procedere ai passaggi successivi. Tutte le fasi successive devono essere eseguite in condizioni sterili all'interno di una cappa a flusso laminare per evitare contaminazioni.
- Utilizzare ....
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Risultati
L'output tipico ottenuto utilizzando la procedura di nuova concezione nelle piantine di Arabidopsis deeziolate di 4 giorni di vita di tipo selvatico (WT), ecotipo Columbia-0 (Col-0) è mostrato nella Figura 3. In condizioni di controllo (terreni MS integrati con DMSO), la curva biosintetica della clorofilla inizia con un primo burst della sintesi clorofilliana, in cui il pool di protoclorofillidi sintetizzato durante la fase scotomorfogenica della crescita, viene rapidamente converti.......
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Discussione
Passaggi critici del protocollo e risoluzione dei problemi: nessuna luce e prendersi cura della maschera
Come evidenziato direttamente nella descrizione del protocollo di cui sopra, è di fondamentale importanza evitare anche le tracce di luce sia durante la coltivazione delle piantine di piante eziolate che appena prima di iniziare il protocollo11. Nella nostra configurazione, utilizziamo una camera oscura dedicata situata nel fitotrone walk-in e separata dal resto del fitotron.......
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Dichiarazioni
Z.B. e K.P. sono dipendenti del PSI e Martin Trtilek è CEO e proprietario della società PSI che produce l'iReenCAM. Tutti questi autori sono stati coinvolti nello sviluppo dello strumento come descritto in precedenza7.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo Europeo di Sviluppo Regionale-Progetto SINGING PLANT (n. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446). Questo progetto è stato finanziato attraverso il progetto MSCA4Ukraine (ID 1233580), finanziato dall'Unione Europea. Siamo grati a Lenka Sochurkova per il design grafico della Figura 1.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 6-benzilamminopurina | Duchefa Biochemie | B0904.0001 | |
| Foglio di alluminio | Merck | Z691577 | |
| Arabidopsis thaliana Col-0 semi | NASC collezione | N1092 | |
| Camera di coltivazione | PSI | su misura | |
| Dimetilsulfoxide | Thermo Fisher Scientific | 042780.AK | |
| Eppendorf monocanale, variabile (100-1000 μ L) | Merck | EP3123000063 | |
| Gelrite | Duchefa Biochemie | G1101 | |
| iReenCAM dispositivo | PSI | su misura/prototipo | |
| Bottiglie da laboratorio, con tappi (Duran), 100mL | Merck | Z305170-10EA | |
| Scatola a flusso laminare | UniGreenScheme | ITEM-31156 | |
| Nastro di giunzione in gomma linerless, larghezza 19 mm, nero, Scienza scozzese | 3M. Applicato a Life | 7000006085 | |
| Provetta per microcentrifuga, 2 mL con coperchio, PPT, MARCA | Merck | BR780546-500EA | |
| Nastro per micropori | 3M Science. Applicato a Life | 7100225115 | |
| Osram lumilux verde l18w/66 | Ovalamp | 200008833 | |
| piastre Petri - Piastre Greiner, quadrate, 120 x 120 x17mm, ventilate | Merck | Z617679-240EA | |
| Punte per pipette, 1000 μ L, Axygen | Merck | AXYT1000B | |
| PSI | l'analisi dei dati sullo schermo | dell'impianto fornito come parte di iReenCAM |
Riferimenti
- Arsovski, A. A., Galstyan, A., Guseman, J. M., Nemhauser, J. L. Photomorphogenesis. Arabidopsis Book. 10, e0147(2012).
- Reinbothe, S., Reinbothe, C., Apel, K., Lebedev, N. Evolution of chlorophyll biosynthesis--the challenge to survive photooxidation. Cell. 86 (5), 703-705 (1996).
- Heyes....
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Ristampe e permessi
