Este protocolo descreve uma plataforma de cultura celular baseada em membrana reconfigurável que integra o formato de poço aberto com recursos de fluxo de fluido. Esta plataforma é compatível com protocolos padrão e permite transições reversíveis entre os modos de cultura de poço aberto e microfluídica, acomodando as necessidades dos laboratórios de engenharia e biociências.
Sistemas microfisiológicos são plataformas de cultura celular miniaturizadas usadas para mimetizar a estrutura e função de tecidos humanos em laboratório. No entanto, essas plataformas não ganharam ampla adoção em laboratórios de biociências, onde abordagens baseadas em membranas de poço aberto servem como padrão-ouro para mimetizar barreiras teciduais, apesar de não terem capacidade de fluxo de fluidos. Esse problema pode ser atribuído principalmente à incompatibilidade dos sistemas microfisiológicos existentes com protocolos e ferramentas padronizadas desenvolvidas para sistemas de poço aberto.
Aqui, apresentamos um protocolo para a criação de uma plataforma reconfigurável baseada em membrana com uma estrutura de poço aberto, capacidade de aumento de fluxo e compatibilidade com protocolos convencionais. Este sistema utiliza uma abordagem de montagem magnética que permite a comutação reversível entre os modos de poço aberto e microfluídico. Com essa abordagem, os usuários têm a flexibilidade de iniciar um experimento no formato de poço aberto usando protocolos padrão e adicionar ou remover recursos de fluxo conforme necessário. Para demonstrar o uso prático desse sistema e sua compatibilidade com técnicas padrão, uma monocamada de células endoteliais foi estabelecida em um formato de poço aberto. O sistema foi reconfigurado para introduzir fluxo de fluido e, em seguida, mudou para o formato de poço aberto para conduzir a imunomarcação e extração de RNA. Devido à sua compatibilidade com protocolos convencionais de poço aberto e capacidade de aumento de fluxo, espera-se que este projeto reconfigurável seja adotado por laboratórios de engenharia e biociências.
As barreiras vasculares servem como uma interface crítica que separa o compartimento sanguíneo do tecido circundante. Desempenham papel fundamental na preservação da homeostase, atraindo células imunes, controlando a permeabilidade molecular e blindando contra a intrusão de patógenos no tecido 1,2. Modelos de cultivo in vitro têm sido desenvolvidos para mimetizar o microambiente in vivo, permitindo investigações sistemáticas sobre os fatores e condições que afetam as propriedades de barreira tanto em estados saudáveis quanto doentes 3,4.
A abordagem mais utilizada para tais modelos de cultura é a configuração Transwell-like “open-well”5, onde uma membrana de cultura porosa e condicionada por trilhos separa compartimentos preenchidos por meios (Figura 1A). Neste formato, as células podem ser semeadas em ambos os lados da membrana, e uma ampla gama de protocolos experimentais foi desenvolvida. No entanto, esses sistemas são limitados em sua capacidade de fornecer os fluxos de fluidos essenciais para suportar a maturação da barreira e mimetizar a circulação de células imunes observadas in vivo 5,6. Consequentemente, não podem ser utilizados para estudos que necessitem de fluxos dinâmicos que introduzam doses de fármacos, estimulação mecânica ou tensões de cisalhamento induzidas por fluidos 6,7,8.
Para superar as limitações dos sistemas de poço aberto, plataformas microfluídicas que combinam membranas de cultura porosas com canais fluídicos endereçáveis individualmente foram desenvolvidas9. Essas plataformas oferecem controle preciso sobre o roteamento de fluidos, perfusão e introdução de compostos químicos, estimulação de cisalhamento controlada e capacidade de adição dinâmica de células 7,10,11,12,13. Apesar das capacidades avançadas proporcionadas pelas plataformas microfluídicas, elas não têm sido amplamente adotadas nos laboratórios de biociências devido aos complexos protocolos microfluídicos e sua incompatibilidade com fluxos de trabalho experimentais estabelecidos4,10,14.
Para preencher a lacuna entre essas tecnologias, apresentamos um protocolo que emprega um sistema baseado em módulos reconfigurável magneticamente. Este sistema pode ser facilmente alternado entre os modos de poço aberto e microfluídico com base nas necessidades específicas do experimento. A plataforma possui um dispositivo de poço aberto, conhecido como m-μSiM (sistema microfisiológico modular habilitado por uma membrana de silício), com uma membrana de cultura de 100 nm de espessura (nanomembrana). Esta nanomembrana possui alta porosidade (15%) e transparência semelhante a vidro, como ilustrado na Figura 1B. Ele separa fisicamente o compartimento superior de um canal inferior, permitindo o transporte molecular através de escalas de comprimento fisiológico15. Ao contrário das membranas convencionais gravadas por trilhos, que têm desafios conhecidos na obtenção de imagens de células vivas com imagens de campo claro, as propriedades ópticas e físicas favoráveis da nanomembrana permitem a visualização clara das células em ambos os lados da superfície da membrana 15,16,17.
O presente protocolo descreve a fabricação de módulos especializados de semeadura e fluxo e explica a reconfiguração magnética da plataforma. Isso demonstra como a plataforma pode ser empregada para estabelecer barreiras endoteliais em condições estáticas e dinâmicas. Esta demonstração revela que as células endoteliais alinham-se ao longo da direção do fluxo, com uma upregulation de alvos gênicos sensíveis ao cisalhamento sob estimulação de cisalhamento.
O objetivo deste protocolo é desenvolver um método prático para incorporar capacidades de fluxo em uma plataforma de poço aberto com uma nanomembrana ultrafina. Neste projeto, uma abordagem de travamento magnético é utilizada, permitindo alternar entre os modos de poço aberto e fluídico durante os experimentos e combinando as vantagens de ambas as abordagens. Ao contrário das plataformas convencionais com ligação permanente, o travamento magnético permite que a plataforma seja desmontada em pontos conveniente…
The authors have nothing to disclose.
Esta pesquisa foi financiada em parte pelo Instituto Nacional de Saúde sob os números de prêmio R43GM137651, R61HL154249, R16GM146687 e concessão da NSF CBET 2150798. Os autores agradecem à Oficina de Máquinas RIT pela fabricação de moldes de alumínio. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do National Institutes of Health.
0.5 x 0.86 Micro Flow tubes | Langer Instruments | WX10-14 & DG Series | |
1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex | VWR | 95039-090 | |
1x PBS 7.4 pH | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP | Jensen Global | JG20-1.5X | |
21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP | Jensen Global | JG21-1.0HPX-90 | |
3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9726-ND | |
3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9720-ND | |
AlexaFluor 488 conjugated phalloidin | ThermoFisher Scientific | A12379 | |
Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444556 | |
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g | VWR | AAJ64100-09 | |
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K171 | 12" x 12" x 1/16" |
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8589K31 | 12" x 12" x 3/32" |
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K191 | 12" x 12" x 7.64" |
Corning Fibronectin, Human, 1 mg | Corning | 47743-728 | |
Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm | VWR | 10118-677 | |
DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 | |
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
Fixture A1&A2 | SiMPore Inc. | NA | |
Fixture B1&B2 | SiMPore Inc. | NA | |
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 4374966 | |
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | ThermoFisher Scientific | C0035C | |
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force) | K&J Magnetics | D31 | 3/16" dia. x 1/16" thick |
Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar | Fisher Scientific | aa47392-9M | |
Peristaltic Pump | Langer Instruments | BQ50-1J-A | |
Photoresist SU-8 developer solution | Fisher Scientific | NC9901158 | |
PVDF syringe filters | PerkinElmer | 2542913 | |
Silicon wafer | University wafer,USA | 1196 | |
SU-8 3050 | Fisher Scientific | NC0702369 | |
Target gene: eNOS (Hs01574659_m1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | 28352 | |
Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile | VWR | 100500-422 | |
TRI-reagent | ThermoFisher Scientific | AM9738 | |
Ultrathin Nanoporous Membrane Chip | SiMPore Inc. | NPSN100-1L | The design is compatible with all of SiMPore membranes |
uSiM component 1 | SiMPore Inc. | NA | |
uSiM component 2 | SiMPore Inc. | NA |