गतिशील माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम में स्टेटिक बैरियर ऊतक मॉडल को बदलना
Summary
यह प्रोटोकॉल एक पुन: कॉन्फ़िगर करने योग्य झिल्ली-आधारित सेल संस्कृति मंच का वर्णन करता है जो द्रव प्रवाह क्षमताओं के साथ ओपन-वेल प्रारूप को एकीकृत करता है। यह मंच मानक प्रोटोकॉल के साथ संगत है और इंजीनियरिंग और बायोसाइंस प्रयोगशालाओं दोनों की जरूरतों को समायोजित करते हुए, ओपन-वेल और माइक्रोफ्लुइडिक कल्चर मोड के बीच प्रतिवर्ती संक्रमण की अनुमति देता है।
Abstract
माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम एक प्रयोगशाला सेटिंग में मानव ऊतकों की संरचना और कार्य की नकल करने के लिए उपयोग किए जाने वाले लघु सेल कल्चर प्लेटफॉर्म हैं। हालांकि, इन प्लेटफार्मों ने जैव विज्ञान प्रयोगशालाओं में व्यापक रूप से अपनाया नहीं है, जहां द्रव प्रवाह क्षमताओं की कमी के बावजूद, ऊतक बाधाओं की नकल करने के लिए खुले-कुएं, झिल्ली-आधारित दृष्टिकोण स्वर्ण मानक के रूप में कार्य करते हैं। इस मुद्दे को मुख्य रूप से ओपन-वेल सिस्टम के लिए विकसित मानक प्रोटोकॉल और उपकरणों के साथ मौजूदा माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम की असंगति के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है।
यहां, हम एक ओपन-वेल संरचना, प्रवाह वृद्धि क्षमता और पारंपरिक प्रोटोकॉल के साथ संगतता के साथ एक पुन: कॉन्फ़िगर करने योग्य झिल्ली-आधारित मंच बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह प्रणाली एक चुंबकीय असेंबली दृष्टिकोण का उपयोग करती है जो ओपन-वेल और माइक्रोफ्लुइडिक मोड के बीच प्रतिवर्ती स्विचिंग को सक्षम बनाती है। इस दृष्टिकोण के साथ, उपयोगकर्ताओं को मानक प्रोटोकॉल का उपयोग कर खुली अच्छी तरह से प्रारूप में एक प्रयोग शुरू करने और जोड़ने या आवश्यकतानुसार प्रवाह क्षमताओं को हटाने के लिए लचीलापन है. इस प्रणाली के व्यावहारिक उपयोग और मानक तकनीकों के साथ इसकी संगतता को प्रदर्शित करने के लिए, एक एंडोथेलियल सेल मोनोलेयर को एक ओपन-वेल प्रारूप में स्थापित किया गया था। द्रव प्रवाह को पेश करने के लिए सिस्टम को पुन: कॉन्फ़िगर किया गया था और फिर इम्यूनोस्टेनिंग और आरएनए निष्कर्षण का संचालन करने के लिए ओपन-वेल प्रारूप में स्विच किया गया था। पारंपरिक ओपन-वेल प्रोटोकॉल और प्रवाह वृद्धि क्षमता के साथ इसकी संगतता के कारण, इस पुन: कॉन्फ़िगर करने योग्य डिजाइन को इंजीनियरिंग और बायोसाइंस प्रयोगशालाओं दोनों द्वारा अपनाया जाने की उम्मीद है।
Introduction
संवहनी बाधाएं एक महत्वपूर्ण इंटरफ़ेस के रूप में काम करती हैं जो रक्त डिब्बे को आसपास के ऊतक से अलग करती हैं। वे प्रतिरक्षा कोशिकाओं को आकर्षित करके, आणविक पारगम्यता को नियंत्रित करके, और ऊतक 1,2 में रोगजनकों की घुसपैठ के खिलाफ परिरक्षण करके होमियोस्टैसिस को संरक्षित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। इन विट्रो संस्कृति मॉडल में विवो microenvironment में नकल करने के लिए विकसित किया गया है, कारकों और शर्तों है कि स्वस्थ और रोगग्रस्तदोनों राज्यों 3,4 में बाधा गुणों को प्रभावित में व्यवस्थित जांच को सक्षम करने.
इस तरह के संस्कृति मॉडल के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया दृष्टिकोण ट्रांसवेल की तरह “खुली अच्छी तरह से” विन्यास5, जहां एक झरझरा, ट्रैक etched संस्कृति झिल्ली मीडिया से भरे डिब्बों (चित्रा 1 ए) अलग है. इस प्रारूप में, कोशिकाओं झिल्ली के दोनों ओर वरीयता प्राप्त किया जा सकता है, और प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की एक विस्तृत श्रृंखला विकसित की गई है. हालांकि, इन प्रणालियों बाधा परिपक्वता का समर्थन और विवो 5,6 में देखा प्रतिरक्षा सेल परिसंचरण की नकल के लिए आवश्यक द्रव प्रवाह प्रदान करने की उनकी क्षमता में सीमित हैं. नतीजतन, वे गतिशील प्रवाह है कि दवा खुराक, यांत्रिक उत्तेजना, या तरल पदार्थ प्रेरित कतरनी तनाव 6,7,8 परिचय की आवश्यकता के अध्ययन के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता.
ओपन-वेल सिस्टम की सीमाओं को दूर करने के लिए, माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म जो व्यक्तिगत रूप से पता करने योग्य तरल पदार्थ चैनलों के साथ झरझरा संस्कृति झिल्ली को जोड़ते हैं,9 विकसित किए गए हैं। ये प्लेटफॉर्म द्रव मार्ग, छिड़काव, और रासायनिक यौगिकों, नियंत्रित कतरनी उत्तेजना, और गतिशील सेल जोड़ क्षमताओं 7,10,11,12,13की शुरूआत पर सटीक नियंत्रण प्रदान करते हैं। माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफार्मों द्वारा प्रदान की उन्नत क्षमताओं के बावजूद, वे जटिल microfluidic प्रोटोकॉल और स्थापित प्रयोगात्मकवर्कफ़्लोज़ 4,10,14के साथ उनकी असंगति के कारण जैव विज्ञान प्रयोगशालाओं में व्यापक गोद लेने नहीं देखा है.
इन प्रौद्योगिकियों के बीच की खाई को पाटने के लिए, हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो चुंबकीय रूप से पुन: कॉन्फ़िगर करने योग्य, मॉड्यूल-आधारित प्रणाली को नियोजित करता है। इस प्रणाली को प्रयोग की विशिष्ट आवश्यकताओं के आधार पर ओपन-वेल और माइक्रोफ्लुइडिक मोड के बीच आसानी से स्विच किया जा सकता है। प्लेटफ़ॉर्म में एक ओपन-वेल डिवाइस है, जिसे m-μSiM (सिलिकॉन झिल्ली द्वारा सक्षम मॉड्यूलर माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम) के रूप में जाना जाता है, जिसमें 100 एनएम मोटी संस्कृति झिल्ली (नैनोमेम्ब्रेन) है। इस नैनोमेम्ब्रेन में उच्च सरंध्रता (15%) और कांच जैसी पारदर्शिता है, जैसा कि चित्र 1बी में दिखाया गया है। यह शारीरिक रूप से एक नीचे चैनल से शीर्ष डिब्बे को अलग करता है, शारीरिक लंबाई तराजू15 भर में आणविक परिवहन के लिए अनुमति देता है. पारंपरिक ट्रैक-नक़्क़ाशीदार झिल्ली के विपरीत, जिनके पास उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग के साथ इमेजिंग लाइव कोशिकाओं में ज्ञात चुनौतियां हैं, नैनोमेम्ब्रेन के अनुकूल ऑप्टिकल और भौतिक गुण झिल्ली सतह15,16,17के दोनों ओर कोशिकाओं के स्पष्ट दृश्य को सक्षम करते हैं।
वर्तमान प्रोटोकॉल विशेष बीजारोपण और प्रवाह मॉड्यूल के निर्माण की रूपरेखा तैयार करता है और मंच के चुंबकीय पुनर्विन्यास की व्याख्या करता है। यह दर्शाता है कि स्थिर और गतिशील दोनों स्थितियों के तहत एंडोथेलियल बाधाओं को स्थापित करने के लिए मंच को कैसे नियोजित किया जा सकता है। इस प्रदर्शन से पता चलता है कि एंडोथेलियल कोशिकाएं प्रवाह दिशा के साथ संरेखित होती हैं, कतरनी उत्तेजना के तहत कतरनी-संवेदनशील जीन लक्ष्यों के अपग्रेडेशन के साथ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य एक ultrathin nanomembrane विशेषता एक खुली अच्छी तरह से मंच में प्रवाह क्षमताओं को शामिल करने के लिए एक व्यावहारिक विधि विकसित करने के लिए है. इस डिजाइन में, एक चुंबकीय latching दृष्टिकोण प्रयोगों ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान द्वारा पुरस्कार संख्या R43GM137651, R61HL154249, R16GM146687 और एनएसएफ अनुदान सीबीईटी 2150798 के तहत वित्त पोषित किया गया था। लेखक एल्यूमीनियम मोल्ड निर्माण के लिए आरआईटी मशीन शॉप को धन्यवाद देते हैं। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करती हो।
Materials
| 0.5 x 0.86 Micro Flow tubes | Langer Instruments | WX10-14 & DG Series | |
| 1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex | VWR | 95039-090 | |
| 1x PBS 7.4 pH | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| 20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP | Jensen Global | JG20-1.5X | |
| 21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP | Jensen Global | JG21-1.0HPX-90 | |
| 3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9726-ND | |
| 3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9720-ND | |
| AlexaFluor 488 conjugated phalloidin | ThermoFisher Scientific | A12379 | |
| Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444556 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g | VWR | AAJ64100-09 | |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K171 | 12" x 12" x 1/16" |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8589K31 | 12" x 12" x 3/32" |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K191 | 12" x 12" x 7.64" |
| Corning Fibronectin, Human, 1 mg | Corning | 47743-728 | |
| Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm | VWR | 10118-677 | |
| DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 | |
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| Fixture A1&A2 | SiMPore Inc. | NA | |
| Fixture B1&B2 | SiMPore Inc. | NA | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 4374966 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | ThermoFisher Scientific | C0035C | |
| LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
| Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force) | K&J Magnetics | D31 | 3/16" dia. x 1/16" thick |
| Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar | Fisher Scientific | aa47392-9M | |
| Peristaltic Pump | Langer Instruments | BQ50-1J-A | |
| Photoresist SU-8 developer solution | Fisher Scientific | NC9901158 | |
| PVDF syringe filters | PerkinElmer | 2542913 | |
| Silicon wafer | University wafer,USA | 1196 | |
| SU-8 3050 | Fisher Scientific | NC0702369 | |
| Target gene: eNOS (Hs01574659_m1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | 28352 | |
| Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile | VWR | 100500-422 | |
| TRI-reagent | ThermoFisher Scientific | AM9738 | |
| Ultrathin Nanoporous Membrane Chip | SiMPore Inc. | NPSN100-1L | The design is compatible with all of SiMPore membranes |
| uSiM component 1 | SiMPore Inc. | NA | |
| uSiM component 2 | SiMPore Inc. | NA |
Riferimenti
- Claesson-Welsh, L., Dejana, E., McDonald, D. M. Permeability of the Endothelial Barrier: Identifying and Reconciling Controversies. Trends in Molecular Medicine. 27 (4), 314-331 (2021).
- Vera, D., et al. Engineering tissue barrier models on hydrogel microfluidic platforms. ACS Applied Materials & Interfaces. 13 (12), 13920-13933 (2021).
- Wang, Y. I., Abaci, H. E., Shuler, M. L. Microfluidic blood-brain barrier model provides in vivo-like barrier properties for drug permeability screening. Biotechnology and Bioengineering. 114 (1), 184-194 (2017).
- Sakolish, C. M., Esch, M. B., Hickman, J. J., Shuler, M. L., Mahler, G. J. Modeling barrier tissues in vitro: methods, achievements, and challenges. eBioMedicine. 5, 30-39 (2016).
- Kaisar, M. A., et al. New experimental models of the blood-brain barrier for CNS drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (1), 89-103 (2017).
- Tan, K., et al. A high-throughput microfluidic microphysiological system (PREDICT-96) to recapitulate hepatocyte function in dynamic, re-circulating flow conditions. Lab on a Chip. 19 (9), 1556-1566 (2019).
- Ayuso, J. M., Virumbrales-Muñoz, M., Lang, J. M., Beebe, D. J. A role for microfluidic systems in precision medicine. Nature Communications. 13 (1), 3086 (2022).
- Katt, M. E., Shusta, E. V. In vitro models of the blood-brain barrier: building in physiological complexity. Current Opinion in Chemical Engineering. 30, 42-52 (2020).
- Ingber, D. E. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nature Reviews Genetics. 23 (8), 467-491 (2022).
- Duncombe, T. A., Tentori, A. M., Herr, A. E. Microfluidics: reframing biological enquiry. Nature reviews. Molecular cell biology. 16 (9), 554-567 (2015).
- Williams, M. J., et al. A low-cost, rapidly integrated debubbler (rid) module for microfluidic cell culture applications. Micromachines. 10 (6), 360 (2019).
- Ahmed, A., et al. Engineering fiber anisotropy within natural collagen hydrogels. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 320 (6), C1112-C1124 (2021).
- Ahmed, A., et al. Microengineered 3D collagen gels with independently tunable fiber anisotropy and directionality. Advanced Materials Technologies. 6 (4), 2001186 (2021).
- Łach, A., Wnuk, A., Wójtowicz, A. K. Experimental models to study the functions of the blood-brain barrier. Bioingegneria. 10 (5), 519 (2023).
- McCloskey, M. C., et al. The Modular µSiM: A mass produced, rapidly assembled, and reconfigurable platform for the study of barrier tissue models in vitro. Advanced Healthcare Materials. 11 (18), 2200804 (2022).
- Mansouri, M., et al. The modular µsim reconfigured: integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow. Advanced Healthcare Materials. 11 (21), 2200802 (2022).
- Hudecz, D., et al. Modelling a human blood-brain barrier co-culture using an ultrathin silicon nitride membrane-based microfluidic device. International Journal of Molecular Sciences. 24 (6), 5624 (2023).
- Joshi, I. M., et al. Microengineering 3D Collagen Matrices with Tumor-Mimetic Gradients in Fiber Alignment. bioRxiv. , (2023).
- Hsu, M. C., et al. A miniaturized 3D printed pressure regulator (µPR) for microfluidic cell culture applications. Scientific Reports. 12 (1), 10769 (2022).
- Rogers, M. T., et al. A high-throughput microfluidic bilayer co-culture platform to study endothelial-pericyte interactions. Scientific reports. 11 (1), 12225 (2021).
- Wettschureck, N., Strilic, B., Offermanns, S. Passing the vascular barrier: endothelial signaling processes controlling extravasation. Physiological Reviews. 99 (3), 1467-1525 (2019).
- Wang, Y. I., Shuler, M. L. UniChip enables long-term recirculating unidirectional perfusion with gravity-driven flow for microphysiological systems. Lab on a Chip. 18 (17), 2563-2574 (2018).
- Nayak, L., Lin, Z., Jain, M. K. 34;Go with the flow": how Krüppel-like factor 2 regulates the vasoprotective effects of shear stress. Antioxidants & Redox Signaling. 15 (5), 1449-1461 (2011).
- Satoh, T., et al. A pneumatic pressure-driven multi-throughput microfluidic circulation culture system. Lab on a chip. 16 (12), 2339-2348 (2016).
- Abhyankar, V. V., Wu, M., Koh, C. Y., Hatch, A. V. A Reversibly sealed, easy access, modular (seam) microfluidic architecture to establish in vitro tissue interfaces. PLOS ONE. 11 (5), e0156341 (2016).
- Ahmed, A., et al. Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3D collagen hydrogels. Biofabrication. 14 (3), 035019 (2022).
- Hasan, M. R., et al. One-step fabrication of flexible nanotextured PDMS as a substrate for selective cell capture. Biomedical Physics & Engineering Express. 4 (2), 025015 (2018).
- Ahmed, A., et al. Microengineering 3D collagen hydrogels with long-range fiber alignment. Journal of Visualized Experiments. 187, e64457 (2022).
