Этот протокол описывает реконфигурируемую платформу клеточных культур на основе мембраны, которая объединяет формат открытой лунки с возможностями потока жидкости. Эта платформа совместима со стандартными протоколами и позволяет осуществлять обратимые переходы между режимами культивирования в открытых лунках и микрофлюидными культурами, удовлетворяя потребности как инженерных, так и бионаучных лабораторий.
Микрофизиологические системы представляют собой миниатюрные платформы для клеточных культур, используемые для имитации структуры и функций тканей человека в лабораторных условиях. Тем не менее, эти платформы не получили широкого распространения в бионаучных лабораториях, где мембранные подходы с открытыми лунками служат золотым стандартом для имитации тканевых барьеров, несмотря на отсутствие возможностей для потока жидкости. Эта проблема может быть связана, прежде всего, с несовместимостью существующих микрофизиологических систем со стандартными протоколами и инструментами, разработанными для систем с открытыми лунками.
В этой статье мы представляем протокол для создания реконфигурируемой мембранной платформы со структурой открытого ствола, возможностью увеличения потока и совместимостью с обычными протоколами. В этой системе используется подход магнитной сборки, который обеспечивает обратимое переключение между режимами открытой скважины и микрофлюидным режимом. При таком подходе пользователи могут начать эксперимент в формате открытой скважины с использованием стандартных протоколов и добавлять или удалять возможности потока по мере необходимости. Для демонстрации практического использования этой системы и ее совместимости со стандартными методиками был создан монослой эндотелиальных клеток в формате открытого лунки. Система была перенастроена для введения потока жидкости, а затем переведена в формат открытой лунки для проведения иммуноокрашивания и экстракции РНК. Благодаря совместимости с традиционными протоколами работы с открытыми скважинами и возможности увеличения потока, ожидается, что эта реконфигурируемая конструкция будет принята как инженерными, так и биологическими лабораториями.
Сосудистые барьеры служат критически важным интерфейсом, который отделяет отсек крови от окружающих тканей. Они играют важнейшую роль в сохранении гомеостаза, привлекая иммунные клетки, контролируя молекулярную проницаемость и защищая от вторжения патогенов в ткань 1,2. Были разработаны модели культивирования in vitro, имитирующие микроокружение in vivo, что позволяет систематически исследовать факторы и условия, влияющие на барьерные свойства как в здоровом, так и в больном состоянии 3,4.
Наиболее широко используемым подходом для таких моделей культивирования является конфигурация 5, подобная конфигурации «открытая скважина»5, в которой пористая мембрана для культивирования с трековым травлением разделяет заполненные средой отсеки (рис. 1A). В этом формате клетки могут быть засеяны с любой стороны мембраны, и был разработан широкий спектр экспериментальных протоколов. Тем не менее, эти системы ограничены в своей способности обеспечивать потоки жидкости, необходимые для поддержки созревания барьеров и имитации циркуляции иммунных клеток, наблюдаемой in vivo 5,6. Следовательно, они не могут быть использованы для исследований, требующих динамических потоков, которые вводят дозы лекарств, механическое раздражение или индуцированные жидкостью сдвиговые напряжения 6,7,8.
Для преодоления ограничений систем с открытыми скважинами были разработаны микрофлюидные платформы, сочетающие пористые мембраны культур с индивидуально адресуемыми флюидными каналами9. Эти платформы обеспечивают точный контроль над маршрутизацией жидкости, перфузией и введением химических соединений, контролируемой стимуляцией сдвига и возможностями динамического добавления клеток 7,10,11,12,13. Несмотря на расширенные возможности, предоставляемые микрофлюидными платформами, они не получили широкого распространения в бионаучных лабораториях из-за сложных микрофлюидных протоколов и их несовместимости с установленными экспериментальными рабочими процессами 4,10,14.
Чтобы преодолеть разрыв между этими технологиями, мы представляем протокол, в котором используется магнитно реконфигурируемая модульная система. Эта система может легко переключаться между режимами открытой скважины и микрофлюидным режимом в зависимости от конкретных потребностей эксперимента. Платформа представляет собой устройство с открытой лункой, известное как m-μSiM (модульная микрофизиологическая система на основе кремниевой мембраны), с культуральной мембраной (наномембраной) толщиной 100 нм. Эта наномембрана обладает высокой пористостью (15%) и стеклоподобной прозрачностью, как показано на рисунке 1B. Он физически отделяет верхний отсек от нижнего канала, обеспечивая молекулярный транспорт по физиологическим шкалам длины15. В отличие от обычных трековых мембран, которые имеют известные проблемы при визуализации живых клеток с помощью визуализации в светлом поле, благоприятные оптические и физические свойства наномембраны позволяют четко визуализировать клетки по обе стороны поверхности мембраны 15,16,17.
В настоящем протоколе описывается изготовление специализированных модулей посева и потока, а также объясняется магнитная реконфигурация платформы. Он демонстрирует, как платформа может быть использована для создания эндотелиальных барьеров как в статических, так и в динамических условиях. Эта демонстрация показывает, что эндотелиальные клетки выстраиваются вдоль направления потока, с повышением регуляции чувствительных к сдвигу генов-мишеней при стимуляции сдвигом.
Целью данного протокола является разработка практического метода включения возможностей потока в открытую платформу с ультратонкой наномембраной. В данной конструкции используется магнитная фиксация, позволяющая переключаться между открытым и флюидным режимами во время экспериме?…
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было частично профинансировано Национальным институтом здравоохранения в рамках грантов R43GM137651, R61HL154249, R16GM146687 и гранта NSF CBET 2150798. Авторы благодарят RIT Machine Shop за изготовление алюминиевых форм. Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.
0.5 x 0.86 Micro Flow tubes | Langer Instruments | WX10-14 & DG Series | |
1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex | VWR | 95039-090 | |
1x PBS 7.4 pH | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP | Jensen Global | JG20-1.5X | |
21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP | Jensen Global | JG21-1.0HPX-90 | |
3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9726-ND | |
3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9720-ND | |
AlexaFluor 488 conjugated phalloidin | ThermoFisher Scientific | A12379 | |
Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444556 | |
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g | VWR | AAJ64100-09 | |
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K171 | 12" x 12" x 1/16" |
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8589K31 | 12" x 12" x 3/32" |
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K191 | 12" x 12" x 7.64" |
Corning Fibronectin, Human, 1 mg | Corning | 47743-728 | |
Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm | VWR | 10118-677 | |
DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 | |
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
Fixture A1&A2 | SiMPore Inc. | NA | |
Fixture B1&B2 | SiMPore Inc. | NA | |
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 4374966 | |
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | ThermoFisher Scientific | C0035C | |
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force) | K&J Magnetics | D31 | 3/16" dia. x 1/16" thick |
Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar | Fisher Scientific | aa47392-9M | |
Peristaltic Pump | Langer Instruments | BQ50-1J-A | |
Photoresist SU-8 developer solution | Fisher Scientific | NC9901158 | |
PVDF syringe filters | PerkinElmer | 2542913 | |
Silicon wafer | University wafer,USA | 1196 | |
SU-8 3050 | Fisher Scientific | NC0702369 | |
Target gene: eNOS (Hs01574659_m1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | 28352 | |
Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile | VWR | 100500-422 | |
TRI-reagent | ThermoFisher Scientific | AM9738 | |
Ultrathin Nanoporous Membrane Chip | SiMPore Inc. | NPSN100-1L | The design is compatible with all of SiMPore membranes |
uSiM component 1 | SiMPore Inc. | NA | |
uSiM component 2 | SiMPore Inc. | NA |