Bu protokol, açık kuyu formatını sıvı akış yetenekleriyle bütünleştiren yeniden yapılandırılabilir bir membran tabanlı hücre kültürü platformunu açıklar. Bu platform standart protokollerle uyumludur ve hem mühendislik hem de biyobilim laboratuvarlarının ihtiyaçlarını karşılayarak açık kuyu ve mikroakışkan kültür modları arasında tersine çevrilebilir geçişlere izin verir.
Mikrofizyolojik sistemler, laboratuvar ortamında insan dokularının yapısını ve işlevini taklit etmek için kullanılan minyatür hücre kültürü platformlarıdır. Bununla birlikte, bu platformlar, sıvı akış yeteneklerinden yoksun olmasına rağmen, açık kuyulu, membran tabanlı yaklaşımların doku bariyerlerini taklit etmek için altın standart olarak hizmet ettiği biyobilim laboratuvarlarında yaygın olarak benimsenmemiştir. Bu sorun öncelikle mevcut mikrofizyolojik sistemlerin açık kuyu sistemleri için geliştirilen standart protokoller ve araçlarla uyumsuzluğuna bağlanabilir.
Burada, açık kuyu yapısına, akış geliştirme kabiliyetine ve geleneksel protokollerle uyumluluğa sahip yeniden yapılandırılabilir membran tabanlı bir platform oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Bu sistem, açık kuyu ve mikroakışkan modlar arasında tersine çevrilebilir geçiş sağlayan bir manyetik montaj yaklaşımı kullanır. Bu yaklaşımla kullanıcılar, standart protokolleri kullanarak açık kuyu biçiminde bir deneye başlama ve gerektiğinde akış özellikleri ekleme veya kaldırma esnekliğine sahip olur. Bu sistemin pratik kullanımını ve standart tekniklerle uyumluluğunu göstermek için, açık kuyu formatında bir endotel hücre tek tabakası oluşturulmuştur. Sistem, sıvı akışını sağlamak için yeniden yapılandırıldı ve daha sonra immün boyama ve RNA ekstraksiyonu yapmak için açık kuyu formatına geçildi. Konvansiyonel açık kuyu protokolleri ile uyumluluğu ve akış geliştirme kabiliyeti nedeniyle, bu yeniden yapılandırılabilir tasarımın hem mühendislik hem de biyobilim laboratuvarları tarafından benimsenmesi beklenmektedir.
Vasküler bariyerler, kan bölmesini çevreleyen dokudan ayıran kritik bir arayüz görevi görür. Bağışıklık hücrelerini çekerek, moleküler geçirgenliği kontrol ederek ve patojenlerin dokuya girmesine karşı kalkan oluşturarak homeostazın korunmasında kritik bir rol oynarlar 1,2. İn vivo mikroçevreyi taklit etmek için in vitro kültür modelleri geliştirilmiştir ve hem sağlıklı hem de hastalıklı durumlarda bariyer özelliklerini etkileyen faktörlerin ve koşulların sistematik olarak araştırılmasını sağlar 3,4.
Bu tür kültür modelleri için en yaygın kullanılan yaklaşım, gözenekli, iz ile kazınmış bir kültür zarının ortamla dolu bölmeleri ayırdığı Transwell benzeri “açık kuyu” konfigürasyonu5’tir (Şekil 1A). Bu formatta, hücreler zarın her iki tarafına da ekilebilir ve çok çeşitli deneysel protokoller geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu sistemler, in vivo 5,6’da görülen bariyer olgunlaşmasını desteklemek ve bağışıklık hücresi dolaşımını taklit etmek için gerekli olan sıvı akışlarını sağlama yetenekleri bakımından sınırlıdır. Sonuç olarak, ilaç dozları, mekanik stimülasyon veya sıvı kaynaklı kesme gerilmeleri 6,7,8 uygulayan dinamik akışlar gerektiren çalışmalar için kullanılamazlar.
Açık kuyu sistemlerinin sınırlamalarının üstesinden gelmek için, gözenekli kültür membranlarını ayrı ayrı adreslenebilir akışkan kanallarla birleştiren mikroakışkan platformlar geliştirilmiştir9. Bu platformlar, sıvı yönlendirme, perfüzyon ve kimyasal bileşiklerin eklenmesi, kontrollü kesme stimülasyonu ve dinamik hücre ekleme yetenekleri üzerinde hassas kontrol sunar 7,10,11,12,13. Mikroakışkan platformlar tarafından sağlanan gelişmiş yeteneklere rağmen, karmaşık mikroakışkan protokoller ve yerleşik deneysel iş akışlarıyla uyumsuzlukları nedeniyle biyobilim laboratuvarlarında yaygın olarak benimsenmemişlerdir 4,10,14.
Bu teknolojiler arasındaki boşluğu doldurmak için, manyetik olarak yeniden yapılandırılabilir, modül tabanlı bir sistem kullanan bir protokol sunuyoruz. Bu sistem, deneyin özel ihtiyaçlarına göre açık kuyu ve mikroakışkan modları arasında kolayca değiştirilebilir. Platform, 100 nm kalınlığında bir kültür zarına (nanomembran) sahip m-μSiM (silikon membran tarafından etkinleştirilen modüler mikrofizyolojik sistem) olarak bilinen açık kuyulu bir cihaza sahiptir. Bu nanomembran, Şekil 1B’de gösterildiği gibi yüksek gözenekliliğe (% 15) ve cam benzeri şeffaflığa sahiptir. Üst bölmeyi bir alt kanaldan fiziksel olarak ayırır ve fizyolojik uzunluk ölçekleri15 boyunca moleküler taşımaya izin verir. Parlak alan görüntüleme ile canlı hücrelerin görüntülenmesinde bilinen zorluklara sahip olan geleneksel iz kazınmış membranların aksine, nanomembranın uygun optik ve fiziksel özellikleri, membran yüzeyinin her iki tarafındaki hücrelerin net bir şekilde görselleştirilmesini sağlar 15,16,17.
Mevcut protokol, özel tohumlama ve akış modüllerinin imalatını özetlemekte ve platformun manyetik olarak yeniden yapılandırılmasını açıklamaktadır. Platformun hem statik hem de dinamik koşullar altında endotel bariyerleri oluşturmak için nasıl kullanılabileceğini gösterir. Bu gösteri, endotel hücrelerinin, kayma stimülasyonu altında kaymaya duyarlı gen hedeflerinin yukarı regülasyonu ile akış yönü boyunca hizalandığını ortaya koymaktadır.
Bu protokolün amacı, akış yeteneklerini ultra ince bir nanomembran içeren bir açık kuyu platformuna dahil etmek için pratik bir yöntem geliştirmektir. Bu tasarımda, deneyler sırasında açık kuyu ve akışkan modları arasında geçişe izin veren ve her iki yaklaşımın avantajlarını birleştiren manyetik bir kilitleme yaklaşımı kullanılmıştır. Geleneksel kalıcı olarak bağlı platformların aksine, manyetik kilitleme, platformun deneysel iş akışı 16,25,26,27</su…
The authors have nothing to disclose.
Bu araştırma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüsü tarafından R43GM137651, R61HL154249, R16GM146687 ve NSF hibe CBET 2150798 altında finanse edildi. Yazarlar, alüminyum kalıp imalatı için RIT Machine Shop’a teşekkür ediyor. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri’nin resmi görüşlerini temsil etmeyebilir.
0.5 x 0.86 Micro Flow tubes | Langer Instruments | WX10-14 & DG Series | |
1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex | VWR | 95039-090 | |
1x PBS 7.4 pH | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP | Jensen Global | JG20-1.5X | |
21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP | Jensen Global | JG21-1.0HPX-90 | |
3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9726-ND | |
3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9720-ND | |
AlexaFluor 488 conjugated phalloidin | ThermoFisher Scientific | A12379 | |
Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444556 | |
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g | VWR | AAJ64100-09 | |
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K171 | 12" x 12" x 1/16" |
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8589K31 | 12" x 12" x 3/32" |
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K191 | 12" x 12" x 7.64" |
Corning Fibronectin, Human, 1 mg | Corning | 47743-728 | |
Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm | VWR | 10118-677 | |
DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 | |
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
Fixture A1&A2 | SiMPore Inc. | NA | |
Fixture B1&B2 | SiMPore Inc. | NA | |
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 4374966 | |
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | ThermoFisher Scientific | C0035C | |
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force) | K&J Magnetics | D31 | 3/16" dia. x 1/16" thick |
Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar | Fisher Scientific | aa47392-9M | |
Peristaltic Pump | Langer Instruments | BQ50-1J-A | |
Photoresist SU-8 developer solution | Fisher Scientific | NC9901158 | |
PVDF syringe filters | PerkinElmer | 2542913 | |
Silicon wafer | University wafer,USA | 1196 | |
SU-8 3050 | Fisher Scientific | NC0702369 | |
Target gene: eNOS (Hs01574659_m1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | 28352 | |
Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile | VWR | 100500-422 | |
TRI-reagent | ThermoFisher Scientific | AM9738 | |
Ultrathin Nanoporous Membrane Chip | SiMPore Inc. | NPSN100-1L | The design is compatible with all of SiMPore membranes |
uSiM component 1 | SiMPore Inc. | NA | |
uSiM component 2 | SiMPore Inc. | NA |