Collecte sur le terrain et entretien en laboratoire du varech géant formant le couvert forestier pour faciliter la restauration

Summary

Ce protocole décrit la collecte sur le terrain et l’entretien régulier en laboratoire de substrats ensemencés de varech géant formant un couvert forestier pour une utilisation dans des essais de restauration visant à examiner le succès et les limites de la technique du « gravier vert » sur le terrain.

Abstract

Les varechs formant le couvert forestier sont des espèces fondamentales essentielles, soutenant la biodiversité et fournissant des services écosystémiques évalués à plus de 500 milliards de dollars américains par an. Le déclin mondial des forêts de varech géant en raison des facteurs de stress écologiques liés au climat souligne la nécessité de stratégies de restauration innovantes. Une technique de restauration émergente connue sous le nom de « gravier vert » vise à semer de jeunes varechs sur de grandes surfaces sans travail sous-marin important et représente un outil de restauration prometteur en raison de sa rentabilité et de son évolutivité. Cet article vidéo illustre un protocole et des outils pour la culture du varech géant, Macrocystis pyrifera. Il fournit également une ressource pour d’autres études visant à examiner les succès et les limites de cette méthode sur le terrain. Nous décrivons des méthodes sur le terrain et en laboratoire pour collecter des tissus reproducteurs, sporuler, inoculer, élever, entretenir et surveiller les substrats ensemencés avec les premiers stades de vie en utilisant la technique du « gravier vert ». Le protocole simplifie et centralise les pratiques de restauration actuelles dans ce domaine afin d’aider les chercheurs, les gestionnaires et les intervenants à atteindre les objectifs de conservation du varech.

Introduction

Les varechs formant la canopée (macroalgues brunes de l’ordre des Laminariales) sont des espèces fondamentales d’importance mondiale, dominant les récifs rocheux côtiers dans les mers tempérées et arctiques¹. Ces varechs forment des habitats biogéniques structurellement complexes et très productifs, connus sous le nom de forêts de varech, qui abritent des communautés marines taxonomiquement diversifiées². Les forêts de varech du monde entier fournissent de nombreux services écosystémiques aux humains, notamment la production de la pêche commerciale, le cycle du carbone et des nutriments et les possibilités de loisirs, pour une valeur totale estimée à 500 milliards de dollars américains par an³.

Malgré leur valeur substantielle, les forêts de varech sont confrontées à des pressions anthropiques croissantes dans de nombreuses régions³. Le changement climatique représente l’une des menaces les plus importantes pour les varechs en raison du réchauffement à long terme des océans combiné à la fréquence croissante des anomalies de température 3,4,5,6,7. L’augmentation des températures de l’océan est associée à une limitation des nutriments⁸, tandis que l’exposition à un stress thermique supérieur aux seuils physiologiques peut entraîner la mortalité⁹. En combinaison avec des facteurs de stress locaux régionaux variables⁷, les populations de varech diminuent globalement d’environ 2 % par an¹⁰ avec des pertes importantes et des déplacements persistants vers d’autres états communautaires dans certaines régions ^{6,11,12,13,14}. Le rétablissement naturel des populations de varech pourrait ne pas suffire à lui seul à inverser l’ampleur des pertes actuelles et prévues 15,16,17,18, ce qui souligne l’importance d’une restauration active.

Les efforts actuels de restauration du varech peuvent utiliser une combinaison de méthodologies pour rétablir ces espèces fondamentales importantes sur les récifs rocheux côtiers ^3,19. Les méthodologies choisies pour répondre aux préoccupations propres au site dépendent du contexte géographique, des obstacles spécifiques au rétablissement du varech et du contexte socio-écologique¹¹. Comprendre les connexions et l’interdépendance des systèmes socio-écologiques est la clé, et les interventions qui impliquent les institutions locales et obtiennent le soutien des communautés locales augmentent les chances de réussite des efforts de restauration²⁰.

En plus des changements climatiques, la pression des herbivores ou la compétition interspécifique entraîne, diminue ou supprime le rétablissement (p. ex. oursins¹³, poissons herbivores^21,22, algues gazonnières ^9,23 ou algues envahissantes²⁴). La restauration peut se concentrer sur l’élimination de ces facteurs de stress biotiques²⁵, bien que ces méthodes nécessitent des ressources substantielles et un entretien continu¹¹. Pour catalyser le rétablissement des espèces de varech, des efforts ont été déployés pour une approche d’ensemencement direct, par exemple, en pesant des sacs en filet remplis de lames de varech fertiles sur le benthos qui libèrent des zoospores dans l’environnement²⁶. Cette méthode, cependant, prend beaucoup de temps et nécessite une installation et un retrait techniques sous l’eau. D’autres cas se concentrent sur la transplantation de grandes quantités de plantes de donneurs adultes entiers, ce qui peut compromettre des populations de donneurs étroitement associés et vulnérables et est souvent limité à de petites échelles en raison de la dépendance à la transplantation continue²⁷.

Pour les régions où la limitation des spores de varech peut entraver le rétablissement des forêts de varech en raison de la fragmentation de l’habitat, une approche relativement nouvelle de restauration du varech appelée technique du « gravier vert » a été introduite. La technique a été testée avec succès à la station de recherche de Flødevigen, dans le sud de la Norvège²⁸, et représentait une option prometteuse pour la restauration en raison de sa rentabilité et de son évolutivité. Le déroulement de cette technique est le suivant : (1) une solution de spores est créée à partir de tissus fertiles prélevés sur des varechs adultes reproducteurs sur le terrain, puis ensemencée sur de petits substrats, tels que du gravier ; (2) les varechs à un stade précoce sont élevés dans des conditions abiotiques contrôlées en laboratoire sur des substrats ; (3) des substrats avec des sporophytes visibles sont déployés sur le terrain sur des récifs spécifiques sous forme de « gravier vert », où les sporophytes continuent de croître. Notez que les efforts de transplantation typiques des individus adultes nécessitent une installation sous-marine laborieuse et coûteuse par les plongeurs, et la technique du « gravier vert » utilise un déploiement simple à partir de la surface²⁸.

La technique du « gravier vert » est actuellement expérimentée par les membres de nombreux groupes de travail internationaux²⁹ dans différents milieux et plusieurs espèces de varech laminaire. Ce protocole décrit les installations, le matériel et les méthodes nécessaires pour la collecte de tissus, la sporulation, l’ensemencement, les conditions d’élevage, l’entretien régulier et la surveillance du varech à un stade précoce avant de déployer cette technique de restauration sur le terrain à l’aide du varech géant, Macrocystis pyrifera. Ce protocole est une ressource précieuse pour les chercheurs, les gestionnaires et les intervenants qui cherchent à donner un aperçu des succès et des limites de cette méthode avec M. pyrifera dans différents contextes de terrain.

Protocol

Les tissus de varech utilisés comme décrit dans ce protocole ont été collectés et supervisés par le California Department of Fish and Wildlife en vertu du permis S-202020004-20205-001. 1. Préparation des installations et du matériel S’assurer que les installations d’élevage de varech peuvent maintenir la température (10-15 °C), fournir une lumière à spectre complet (0-180 μmol photons m-2 s-1) et filtrer l’aération (taille des pores de 0,2 μm). Utilisez des systèmes d’incubation avec une sortie intégrée ou un port d’accès pour les fils et les tubes, les lumières et une source d’air (Figure 1). Si un système d’incubation n’est pas conforme à la portée, au budget ou à l’échelle prévue du projet, utilisez des bains-marie tempérés par de l’eau de mer naturelle fraîche ou un refroidisseur (figure 2). Reportez-vous à la table des matériaux pour plus de détails.Placez un thermomètre dans le milieu de culture ou utilisez un pistolet à température pour vous assurer que la température est comprise entre 10 et 18 °C.REMARQUE : Les températures d’élevage sont spécifiques au site et à la saison30. Programmez les lumières à spectre complet sur une photopériode de 12 h de lumière : 12 h d’obscurité en modifiant les paramètres de synchronisation de la source lumineuse ou en utilisant une minuterie mécanique. Mesurer l’intensité lumineuse à l’aide d’un compteur quantique de rayonnement photosynthétiquement actif (PAR) étanche sous la surface près du gravier et ajuster à l’aide d’une source lumineuse à intensité variable ou en superposant de la cellophane (dans le cas de la culture végétative de gamétophytes, voir la section 9) ou un maillage sur la source lumineuse (pour plus de détails sur les réglages de l’intensité lumineuse, voir la section 6.3). Assurez-vous d’une bonne aération en utilisant des pompes à air31 un jour après la sporulation. Utilisez des filtres (pores de 0,2 μm) pour réduire la contamination bactérienne en suspension dans l’air.REMARQUE : Pour la culture du « gravier vert », la pression d’aération doit être suffisante pour faire circuler l’eau dans tous les récipients d’élevage sans perturber la fixation du varech au stade précoce des substrats ensemencés. En présence de biomasse de gamétophytes de masse (voir la section 9.2), la pression d’aération doit être suffisante pour maintenir les gamétophytes en suspension dans le milieu de culture. Stériliser le matériel et les stations. Préparez-les à l’avance (voir Tableau des matériaux).Nettoyez les surfaces avec de l’alcool isopropylique à 70 %. Manipulez les tissus de sori reproducteurs et nettoyez le matériel de collecte à l’extérieur de la pépinière de « gravier vert », si possible. Utilisez les méthodes de stérilisation suivantes : rincer à l’aide d’un détergent de qualité laboratoire suivi d’un rinçage complet à l’eau distillée, tremper dans une solution d’eau de Javel diluée (selon les instructions du fabricant) suivi d’un rinçage complet à l’eau distillée et autoclave en utilisant les réglages appropriés (verrerie ou instruments). Après la stérilisation, les matériaux peuvent être stockés dans un récipient scellé ou emballés dans du papier d’aluminium. Frottez et nettoyez les récipients avec les couvercles à utiliser pour la culture avec un détergent de qualité laboratoire, puis rincez abondamment à l’eau distillée.REMARQUE : Les récipients de culture à couvercle aideront à réduire l’évaporation des milieux de culture. Laissez les couvercles légèrement ouverts pour permettre l’échange d’air ou utilisez un clapet anti-retour pour réduire la contamination en suspension dans l’air. Si les récipients à couvercle ne sont pas disponibles, scellez les récipients de culture avec un thermoplastique tel qu’un film de paraffine et faites 2-3 perforations. Si vous utilisez des réservoirs plus grands, utilisez des couvercles anti-évaporation en plastique transparent. S’assurer que le gravier a une surface texturée ou légèrement piquée, car les gamétophytes sont plus susceptibles d’être retenus sur des substrats à forte rugosité32,33. Frottez et rincez le gravier jusqu’à ce que l’eau soit claire pour enlever la poussière ou les débris. Faire tremper le gravier dans une solution d’eau de Javel diluée à 10 % pendant au moins 24 h et rincer à l’eau de mer stérilisée par filtre (voir section 2.1). Alternativement, après avoir frotté et rincé, faire tremper le gravier pendant 1 semaine dans de l’eau désionisée (DI)32.REMARQUE : Idéalement, un substrat récolté localement est utilisé pour réduire la contamination du site de restauration. Alternativement, du gravier de qualité aquarium est recommandé. Évitez les substrats calcaires tels que le calcaire, qui peuvent entraîner le blanchissement des tissus et la mortalité ultérieure des varechs transplantés32. 2. Préparation des milieux de culture Filtrer et stériliser l’eau de mer selon les méthodes suivantes, en fonction de la disponibilité des ressources. Calculer le volume d’eau de mer stérilisée par filtre nécessaire pour rafraîchir les contenants de culture chaque semaine (voir la section 7) et planifier cette tâche de filtration et de stérilisation en conséquence. Conservez de grandes quantités d’eau de mer stérilisée par filtre dans des récipients sombres jusqu’à 6 mois à 8-10 °C. Si la réfrigération n’est pas disponible, conservez-la dans un endroit sombre et frais.Filtrez l’eau à l’aide d’un système de filtration sous vide avec une taille de pores de 0,55 à 1 μm. Éteignez la source d’aspiration avant que toute l’eau ne soit aspirée pour éviter d’endommager le filtre et versez l’eau filtrée dans un récipient stérile dédié. Pour les volumes plus importants, utilisez un système de filtration à écoulement. Par exemple, faites passer l’eau de mer à travers une série de trois filtres plissés (10 μm, 5 μm et 1 μm) disposés de la plus grande à la plus petite taille de pore.REMARQUE : Si l’eau de mer naturelle n’est pas accessible, de l’eau de mer artificielle peut être préparée. Alternativement, l’eau de mer naturelle peut être achetée dans les magasins d’aquarium, en vrac et est souvent filtrée, désinfectée et au pH équilibré. L’enrichissement des médias est toujours nécessaire pour ces options. Stériliser l’eau de mer filtrée à l’aide de méthodes UV et/ou d’autoclavage. Connectez les systèmes à circulation à une lampe UV d’aquarium à un débit recommandé par le fabricant. Autoclave de l’eau de mer dans une verrerie sans danger pour l’autoclave avec des couvercles légèrement ouverts ou recouverte d’une feuille d’aluminium et sur un cycle liquide (121 °C ; 1-2 PSI, 15-30 min selon le volume de liquide34.REMARQUE : L’eau de mer filtrée en autoclavage est recommandée pour les premiers stades de la culture. L’enrichissement de l’eau de mer stérilisée par filtre avec des nutriments et des vitamines est essentiel à la croissance de M. pyrifera . Le milieu d’eau de mer enrichie (PES) Provasoli est un milieu largement utilisé conçu pour les cultures d’algues35. Achetez ce support dans les centres de culture d’algues. Les préparations de PES et de vitamines supplémentaires pour la croissance de M. pyrifera sont décrites en34.Enrichissez chaque 1 L d’eau de mer filtrée avec 20 mL de PES. Vous pouvez également utiliser des milieux de culture de niveau industriel. Stocker les solutions d’enrichissement selon les recommandations du fabricant. Enrichir l’eau de mer stérilisée par filtre lorsque le milieu de culture est nécessaire pour éviter la dégradation des solutions d’enrichissement. 3. Collecte sur le terrain Déterminer le moment des collectes de sporophylles pour imiter le cycle de reproduction naturel des populations locales de M. pyrifera. Consultez des experts locaux (p. ex. chercheurs sur le varech, gestionnaires, écologistes, scientifiques citoyens, groupes de plongée) pour vous assurer que le moment est approprié pour la collecte des sporophylles. Obtenez les permis nécessaires pour la collecte de tissus de varech qui répondent aux lois et réglementations locales. Cela peut prendre beaucoup de temps dans le processus de culture et doit être intégré dans les délais du projet. À l’aide d’un appareil respiratoire sous-marin autonome (SEA), sélectionner 3 à 5 pales sporophylles parmi 10 à 15 individus fertiles de M. pyrifera avec des sories visibles, espacées d’au moins 2 m. Choisir des sporophylles propres et intacts, si possible, avec peu ou pas d’encrassement ou de dégradation. Stocker les lames sporophylles séparément selon l’individu parent à partir de ce moment.REMARQUE : Les sporophylles poussent dans une « jupe » dense à la base, au-dessus de la fixation du varech adulte, et peuvent être identifiées par leur absence de pneumatocystes remplis de gaz1. Le tissu sorus mature est souvent légèrement surélevé et de couleur plus foncée que le tissu environnant1. Transporter les lames de sporophylle dans des sacs de collecte sombres pour éviter une surexposition au soleil, avec un minimum d’eau de mer du site pour garder les lames humides, et les stocker dans des glacières à environ 12 °C jusqu’à l’arrivée à l’espace d’élevage. S’assurer que les échantillons ne sont pas en contact direct avec la glace.REMARQUE : Les sporophylles peuvent être expédiées vers ou depuis d’autres endroits.Rincer les sporophylles à l’eau de mer. Envelopper les pales, prélevées sur un seul individu de M. pyrifera , dans des serviettes en papier humides trempées dans de l’eau de mer et de nouveau dans du papier d’aluminium pour éviter la pénétration de la lumière et la dessiccation supplémentaire36. Cette méthode de stockage est communément appelée « méthode burrito ». Placez ces emballages dans une glacière avec de la glace, avec une barrière protectrice telle que du papier bulle recyclé ou du carton. Préparez la glacière pour l’expédition du jour au lendemain. Assurez-vous que quelqu’un est disponible pour recevoir l’envoi et placez les colis dans des conditions réfrigérées. 4. Sporulation Si possible, traitez les sporophylles dans un environnement à température contrôlée entre 10 et 15 °C et loin de toute autre culture. Préparez et stérilisez les instruments et les stations à l’avance. Portez des gants de protection lorsque vous manipulez des tissus de varech pour réduire la contamination. Conserver éventuellement les sporophylles pendant 12 à 48 h dans des conditions réfrigérées, en favorisant la libération des spores du tissu sorus37. Pour conserver, utilisez la « méthode burrito » décrite à la section 3.3. Sélectionnez le tissu de sorus mûr et coupez-le en25 cm 2 sections à l’aide de ciseaux stériles. Sélectionnez 1 à 2 sections de sori propres parmi 10 à 15 parents de varech individuels, pour favoriser la diversité génétique.REMARQUE : Si vous les entreposez, trouvez éventuellement des traces de sporulation partielle sur les serviettes en papier, indiquant la présence de tissu sorus fertile. Le tissu Sorus est souvent légèrement surélevé et de couleur plus foncée que le tissu environnant. Pour nettoyer, frottez doucement les deux côtés du tissu du sorus dans un seul sens avec une gaze stérile imbibée d’eau de mer stérilisée par filtre. Si nécessaire, grattez doucement le tissu du sorus avec une lame de rasoir stérile pour éliminer complètement l’encrassement. Immerger la section sori dans un bain d’eau douce pendant 30 s à 1 min et rincer à l’eau de mer stérilisée par filtre.REMARQUE : Rafraîchir le bain d’eau douce et stériliser les matériaux utilisés lors de la manipulation de différentes sections de sores de différentes personnes afin de réduire la contamination croisée. Immerger chaque section de sori dans de l’eau de mer stérilisée par filtre tempérée à 10-15 °C dans un tube à centrifuger stérile de 50 ml. Placer les tubes à 4-12 °C dans l’obscurité pour sporuler pendant un maximum de 4 h. Si un réfrigérateur n’est pas disponible, rangez-le dans un endroit frais et peu éclairé.REMARQUE : Alternativement, les sections de sori peuvent être sporulées dans un seul récipient stérile. À l’aide d’un microscope composé et d’un hémocytomètre, observer la densité des spores de 3 à 4 échantillons toutes les 30 minutes jusqu’à 4 h. Changez les pointes de pipette entre les échantillons. Si les densités sont d’au moins 10 000 spores mL-1 (voir la section 5.1.1), passez à l’étape suivante. Si une section de sori ne produit aucune spores après 4 h, jeter l’échantillon. Les spores peuvent se déposer dans les heures qui suivent la libération, mais peuvent être observées nageant dans un mouvement circulaire. Retirez chaque section de sori des tubes avec une pince à épiler stérile. Combinez les solutions de spores résultantes dans un seul récipient stérilisé et quantifiez la densité combinée finale. 5. Inoculation Calculer le volume final de solution de spores nécessaire à l’inoculation. S’assurer que la concentration finale est d’environ 500 à 1 000 spores mL−1 dans les récipients de culture.Pour calculer la concentration de l’échantillon de spores combiné à partir du nombre de numérations de la grille centrale de l’hémocytomètre, divisez le nombre par 10-4 mL (représentant le volume de solution visualisé dans l’hémocytomètre). Pour déterminer le volume de solution de spores à ajouter à chaque contenant, déterminez la quantité de milieu de culture nécessaire pour immerger les substrats dans les contenants de culture. Pour trouver le nombre total de spores dans chaque récipient, multipliez ce volume d’eau de mer par la concentration souhaitée. Pour déterminer le volume total de solution de spores à ajouter, divisez la quantité totale de spores par la concentration de spores par mL dans la solution de spores. Placer les lames de verre stériles dans les contenants de culture pour surveiller le développement du varech. Inclure au moins 30 lames réparties au hasard dans les contenants de culture pour une surveillance suffisante (voir les détails à la section 7). Inoculer le volume calculé de solution de spores dans le récipient de culture à l’aide d’une pointe de pipette stérile contenant des substrats immergés dans un milieu de culture. Fermez le récipient et remuez doucement pour répartir les spores. Scellez et placez le récipient dans le système de culture. 6. Conditions d’élevage Réglez la température entre 10 et 15 °C en fonction de la température sur le site de déploiement. Après 1 jour, aérer légèrement avec une source d’air filtrée. Réglez les lumières LED à spectre complet pour les plantes aquatiques sur une lumière de 12 h : cycle d’obscurité de 12 h, avec des intensités lumineuses comprises entre 0 et 180 μmol photon m-2 s-1 :Réglez l’intensité lumineuse à 5-10 μmol photon m-2 s-1 de 0 à 1 jour et augmentez à 20 – 30 μmol photon m-2 s-1 jusqu’à la fin d’une semaine. À partir de ce moment, augmentez l’irradiance de 10-20 μmol photon m-2 s-1 tous les 3-4 jours jusqu’à atteindre un irradiance de 180 μmol photon m-2 s-1 à la fin de 6 semaines. Continuer à élever des cultures à 180 μmol de photons m-2 s-1 jusqu’à la fin de 8 semaines, ou lorsque les sporophytes ont atteint environ 1 à 2 cm de longueur. 7. Surveillance Surveillez au moins deux lames de verre aléatoires par jour/tous les deux jours pendant les deux premières semaines pour évaluer le développement.Pour surveiller, manipulez la lame avec une pince à épiler stérilisée et placez-la dans une boîte de Pétri propre contenant suffisamment d’eau de mer stérilisée pour immerger la lame de verre. Ne retournez pas les lames de verre dans les cultures après avoir été retirées pour éviter la contamination croisée. Utilisez un microscope composé ou inversé à un grossissement de 40 à 400x pour observer les varechs à un stade précoce. Suivez le développement en suivant la chronologie suivante (voir la figure 3 pour des exemples de stades du cycle biologique du développement).NOTE : Les spores déposées sont observées à 0-1 jour. Les spores peuvent germer en quelques heures, comme le montre la formation d’un tube germinal. La germination est généralement observée à 1-2 jours. Les gamétophytes précoces sont généralement observés entre 1 et 4 jours. La gamétogenèse, le processus par lequel les cellules subissent une division et une différenciation pour former des gamètes mâles et femelles, est généralement observée dans les deux premières semaines. Les cellules femelles sont 5 à 7 fois plus grandes que les cellules masculines. Les gamétophytes mâles développent des branches fines et filamenteuses, tandis que les femelles sont de forme plus ronde ou ovoïde. Les femelles produisent généralement des œufs ou des ovules en 2 à 3 semaines. Le sperme libéré par les mâles nage vers les femelles et féconde les œufs, ce qui entraîne la formation de zygotes diploïdes. Avoir la bonne densité d’inoculation assurera une reproduction réussie par proximité38,39. Les œufs fécondés se développent en sporophytes embryonnaires. Les sporophytes sont généralement observés dans les 2 à 4 semaines. Le zygote subit une division cellulaire rapide, entraînant la croissance de lames de 1 à 2 cm en 6 à 8 semaines environ. Après deux semaines, surveiller au moins deux lames de verre aléatoires 1 à 2 fois par semaine pour une croissance saine et une contamination jusqu’à ce que les sporophytes atteignent une taille de 1 à 2 cm.REMARQUE : Une croissance saine est caractérisée par une coloration brun doré (par opposition au vert ou transparent). Plusieurs paramètres quantitatifs peuvent être observés sur des lames de verre avec un microscope inversé, notamment la survie, le taux de germination, le développement végétatif, la maturité reproductive et la fécondité, et le sex-ratio40. Évaluez la contamination par des bactéries, des champignons, des ciliés et des diatomées avec un microscope. Éliminer la contamination isolée. Contrôler les signes précoces de contamination par les diatomées avec un traitement au dioxyde de germanium (GeO2) (voir section 8.3). 8. Entretien Ajustez les conditions d’éclairage conformément à la section 6.3. Chaque semaine, changez de milieu de culture pour reconstituer les nutriments et les minéraux nécessaires à la croissance de M. pyrifera .Réfrigérer le milieu de croissance frais à la température appropriée. Assurez-vous que la température ne dépasse pas 15 °C pendant ce processus. Siphonnez le milieu hors des conteneurs de culture pour éviter de perturber les substrats ensemencés. Laissez le média s’écouler jusqu’à ce que le récipient soit presque vide. Rafraîchissez immédiatement le support pour minimiser la dessiccation. Lorsque vous remplissez les récipients de culture, inclinez-les légèrement de manière à ce que le milieu coule sur le côté du récipient de culture pour perturber le moins possible les substrats. Réorganisez au hasard les positions des récipients ou des cuves lors des changements hebdomadaires de milieu pour tenir compte des différences d’irradiation lumineuse.REMARQUE : Voir le fichier supplémentaire 1 pour un calendrier permettant de suivre les activités et les attentes concernant les cultures de Macrocystis. Il indique le moment des ajustements de la lumière et de l’aération, ainsi que les changements hebdomadaires de support. En option, contrôler la contamination par les diatomées avec un traitement au dioxyde de germanium (GeO2). Ajouter 0,3 à 0,5 mL de 250 mg/mL de GeO2 à chaque 1 L d’eau de mer ajoutée aux substrats ensemencés pour réduire la contamination généralisée par les diatomées.REMARQUE : GeO2 peut inhiber la production de gamètes d’algues. Appliquer un traitement de GeO2 dans la courte fenêtre suivant la germination et avant les pics de production d’ovules et de spermatozoïdes (1-7 jours) et/ou après la fécondation des ovules et les observations de sporophytes (>21 jours), suivi d’un changement de milieu 48 heures après pour éliminer le produit chimique. Ces délais peuvent varier en fonction des conditions de culture, de sorte que le suivi du stade de développement par microscopie est le meilleur moyen d’évaluer le moment de l’application de GeO2 . Si la contamination par les diatomées persiste dans les conteneurs d’élevage et que l’on observe une prolifération sur les varechs aux premiers stades, envisager de réensemencer les substrats. 9. Culture de gamétophytes végétatifs de varech géant Propager les cultures de gamétophytes dans des conditions végétatives toute l’année pour réduire la dépendance à l’égard de la collecte saisonnière de sporophylles dans le récif naturel.Stocker les cultures de gamétophytes en fonction de la population source dans des flacons remplis de milieu de culture à 4-12 °C en lumière rouge à une intensité de 5-20 μmol photon m-2 s-1 dans un cycle 12 lumière : 12 obscurité. Assurer une aération constante et changer de milieu tous les 2 à 6 mois. Gonfler la biomasse des gamétophytes qui ont poussé de manière asexuée pour les utiliser dans l’ensemencement de « gravier vert », augmenter l’aération pour suspendre les gamétophytes, augmenter la fréquence des changements de milieu à une fois par semaine et fragmenter les gamétophytes toutes les deux semaines.Suspendre la biomasse gamétophyte dans la fiole de culture en secouant ou en remuant et gratter les parois de la fiole de culture avec un outil stérile pour déloger les gamétophytes attachés, si nécessaire. Verser les gamétophytes en suspension dans un mélangeur stérile ou un moulin à café et pulser la solution de gamétophytes pendant 1 à 2 s environ 5 à 15 fois, selon la concentration de biomasse, jusqu’à ce qu’aucune masse agglutinée ne soit visible. Pour induire la reproduction pour l’ensemencement de « gravier vert », fragmenter les gamétophytes, comme expliqué ci-dessus. Ensuite, inoculez le substrat et augmentez la lumière LED à spectre complet de 5-20 à 45-60 μmol photon m-2 s-1 (+10 μmol photon m-2 s-1 par jour pour la photo-acclimatation), puis augmentez de 10-20 μmol photon m-2 s-1 tous les 3-4 jours jusqu’à atteindre un éclairement énergétique de 180 μmol photon m-2 s-1. 10. Déploiement Après 6 à 8 semaines d’élevage en laboratoire, s’assurer que les sporophytes juvéniles mesurent de 1 à 2 cm de long et sont prêts à être déployés (figure 4). Rafraîchir les milieux de culture dans les conteneurs de culture 24 h avant le déploiement. Obtenez les permis nécessaires pour le déploiement de gravier qui répondent aux lois et réglementations locales. Cela peut prendre beaucoup de temps dans le processus de culture et doit être intégré dans les délais du projet. Transportez le « gravier vert » dans des plateaux recouverts de serviettes imbibées d’eau de mer pour garder le varech hydraté. Placez les plateaux dans des glacières isolées avec de la glace, en veillant à ce qu’ils ne soient pas en contact direct avec la glace. Assurez-vous que le « gravier vert » est bien tassé pour éviter le roulement des substrats et le détachement des sporophytes pendant le transport.REMARQUE : Selon l’espace disponible, les substrats peuvent également être transportés dans leurs conteneurs ou bacs de culture pour réduire la manipulation. Transportez le « gravier vert » jusqu’à 6 h dans une glacière ombragée. Le déploiement doit être programmé pour éviter la lumière la plus directe du soleil. Si vous déployez à partir d’un bateau, utilisez une structure ombragée pour éviter le soleil direct pendant le processus de déploiement. Dispersez soigneusement du « gravier vert » de la surface sur le récif en dessous ou par plongée sous-marine lors d’essais sur de nouveaux sites et à petite échelle.

Representative Results

La technique de restauration du « gravier vert » est encore en phase pilote, avec des données limitées sur la survie des semis pour les autres espèces28, et aucune donnée publiée pour Macrocystis pyrifera. À l’aide de la collecte sur le terrain et de l’entretien en laboratoire décrits dans ce protocole, nous avons testé l’importance des conditions d’élevage spécifiques au site pour deux populations distinctes de varech donneur avant un déploiement hypothétique de « gravier vert » (figure 5). Des tissus de varech reproducteurs ont été prélevés en Californie (États-Unis) dans des populations plus froides de K1 (Santa Cruz 36,60167°N, 121,88508°W) et plus chaudes de K4 (San Diego, 32,85036°N, -117,27600°W) et élevés à deux températures : (1) 12 °C (la température d’élevage standard pour l’aquaculture d’algues et la température moyenne de K1 en hiver), et (2) 20 °C (la température moyenne de K4 en été, et une vague de chaleur de 4 °C pour K1). Toutes les lames de verre utilisées pour surveiller le développement du varech au stade de vie ont été marquées avec une grille normalisée, et des images à haute résolution ont été capturées en utilisant cette grille comme référence pour permettre l’observation de champs fixes dans le temps à l’aide d’un microscope inversé et d’une caméra (N = 5 images par échantillon, 2,479 mm x 1,859 mm). Après 24 jours après la sporulation, les gamétophytes ont été comptés à partir d’images microscopiques (N = 300 images provenant de 60 échantillons). Pour tester les différences dans le nombre de gamétophytes, des modèles linéaires généralisés à effets mixtes ont été utilisés avec la distribution de Poisson en utilisant la fonction glmmTMB() dans le package glmmTMB41, et des comparaisons par paires ont été effectuées avec emtrends() à partir du package emmeans42dans R. Nos résultats montrent que la réponse des gamétophytes à la variabilité thermique était différente entre les populations K1 et K4 (t = 2,7, p = 0,007), où la température n’a pas eu d’effet sur la population K4 plus chaude (estimation = -0,01, erreur type [ET] = 0,01, intervalle de confiance [IC] = [-0,03, 0,01]), mais a eu un effet sur la population K1 plus froide (estimation = -0,06, ET = 0,02, IC = [-0,10, -0,03]) (Figure 6A), suggérant une possible divergence adaptative dans les traits de tolérance thermique. Les gamétophytes de varech sont souvent décrits comme un stadede résistance 43, ce qui signifie qu’ils produisent un phénotype polyvalent tolérant au stress et relativement insensible à la variabilité environnementale. Cependant, ces résultats indiquent que la variabilité thermique impose une pression importante à ce stade précoce. Après 32 jours après la sporulation, des sporophytes visibles d’une longueur supérieure à environ 1 mm ont été dénombrés sur l’ensemble de chaque lame de verre de 2,5 cm sur 7,5 cm (N = 72 échantillons au total). Pour tester les différences dans le nombre de sporophytes visibles, des modèles linéaires généralisés à effets mixtes ont été utilisés avec la distribution de Poisson en utilisant la fonction glmmTMB() dans le package glmmTMB et des comparaisons par paires ont été effectuées avec emtrends() à partir des emmoyens du package dans R. Nos résultats illustrent que la réponse des sporophytes à la variabilité thermique est similaire entre les populations différenciées K1 et K4 (z = 0,92, p = 0,36), où la température a eu un effet sur la population K4 plus chaude (estimation = -0,66, ET = 0,04, IC = [-0,74, – 0,57]), ainsi que sur la population K1 plus froide (estimation = -0,85, ET = 0,13, IC = [-1,10, -0,60]) (Figure 6B). Les échantillons élevés à 20 °C ont produit peu de sporophytes visibles (écart-type moyen ± = 0,4 ± 0,2) par rapport à ceux élevés à 12 °C (écart-type moyen ± = 82,4 ± 9,8). Ce résultat suggère que la production de sporophytes est plus sensible à la température que le stade gamétophyte, et que les températures de culture spécifiques au site ne doivent pas dépasser 15 °C pour atteindre le développement des sporophytes comme indiqué dans le protocole. Figure 1 : Schéma d’un système d’incubateur de « gravier vert ». (A) Source de lumière rouge pour les cultures de gamétophytes en charge végétative. (B) Port d’accès pour les fils électriques et les tubes, menant à une prise externe. (C) Structure pour bloquer la lumière à spectre complet hors de la section rouge. (D) Une section de culture de « gravier vert ». (E) les sources lumineuses à spectre complet. (F) Conduites de tubes raccordées à une source d’air filtré externe. (G) Clapets anti-retour pour réduire la contamination en suspension dans l’air. (H) Contenants de culture individuels qui minimisent la contamination. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Schéma d’un système de bain-marie en « gravier vert ». (A) Refroidisseur avec pompe immergée (en I). (B) Baignoire de 20 gallons pour bain-marie. (C) Vidange pour faire recirculer le bain-marie. (D) Vanne pour la recirculation du bain-marie. (E) Source lumineuse. (F) Récipient de 2,5 L en « gravier vert » avec couvercle transparent et ouverture d’aération. (G) Source d’aération. (H) Tuyaux qui recyclent l’eau à l’aide de pompes immergées. (I) Récepteur du bain-marie de/vers le refroidisseur de/vers les baignoires avec pompes submersibles. (J) Couvercle en acrylique pour minimiser l’évaporation du bain-marie. (K) Abat-jour en maille pour ajuster l’intensité lumineuse. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Développement de Macrocystis pyrifera. Stades du cycle de vie développemental de Macrocystis pyrifera à partir d’essais de croissance en laboratoire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 4 : ‘Gravier vert’ ensemencé de Macrocystis pyrifera. ‘ Le gravier vert ensemencé avec Macrocystis pyrifera est cultivé en laboratoire jusqu’à ce que les sporophytes atteignent 1 à 2 cm. Le gravier vert est ensuite déployé et continue de croître dans le champ. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 5 : Séries chronologiques expérimentales. Exemples d’images d’une série chronologique suivant la croissance et le développement expérimentaux de gamétophytes et de sporophytes de Macrocystis pyrifera provenant de deux populations collectées en Californie (États-Unis) et cultivées à deux températures différentes. K1 = Santa Cruz, K4 = San Diego. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 6 : Résultats représentatifs. Stades de vie de Macrocystis pyrifera observés pour les populations d’origine K1, Santa Cruz, San Diego, K4, Santa Cruz, cultivées dans des conditions thermiques constantes de 12 et 20 °C. Barres d’erreur, moyenne ± 1 ET. L’astérisque (*) indique des différences statistiquement significatives (p < 0,05). (A) Gamétophytes au jour 24 (N = 300 images totales provenant de 60 échantillons). (B) Sporophytes visibles au jour 32 (N = 72 échantillons, dans une zone normalisée de 2,5 cm sur 7,5 cm). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Dossier supplémentaire 1. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Le changement climatique anthropique constitue une menace croissante pour la santé des océans du monde 44,45,46,47,48, entraînant des perturbations majeures et une perte de biodiversité 49,50,51,52. Pour accélérer la restauration des écosystèmes dégradés, les Nations Unies ont déclaré la période 2021-2030 « Décennie des Nations Unies pour la restauration des écosystèmes », coïncidant avec la « Décennie des Nations Unies pour les sciences océaniques au service du développement durable », qui vise à inverser la détérioration de la santé des océans⁵³. Conformément à cet appel mondial à l’action, la Kelp Forest Alliance a lancé le Kelp Forest Challenge pour restaurer 1 million d’hectares et protéger 3 millions d’hectares de forêt de varech d’ici 2040⁵⁴. La restauration marine est sous-évaluée⁵⁵, et les écosystèmes de varech reçoivent beaucoup moins d’attention que des habitats tels que les récifs coralliens, les forêts de mangroves et les prairies sous-marines⁵⁶. La restauration des écosystèmes dégradés s’est avérée efficace pour reconstruire les écosystèmes marins, mais peut coûter en moyenne entre 80 000 et 1 600 000 dollars par hectare, les coûts totaux médians étant probablement deux à quatre fois plus élevés⁵⁷. Les pertes actuelles et prévues nécessitent le développement de méthodologies de restauration du varech évolutives, réalisables et rentables en tant qu’interventions de conservation urgentes.

Les efforts actuels de restauration du varech utilisent une combinaison de méthodologies pour s’attaquer aux facteurs de perte de varech spécifiques au site, notamment la transplantation de varech adultes, l’ensemencement direct de zoospores et/ou de gamétophytes, le contrôle des brouteurs et l’installation de récifs artificiels¹¹. Cependant, ces méthodes nécessitent des ressources importantes et ont une évolutivité limitée. La transplantation typique de varech adulte nécessite le déploiement laborieux de matériaux ou de structures artificielles sur le benthos, par des plongeurs. Les interventions ascendantes visant à rétablir les récifs rocheux côtiers, telles que le contrôle des concurrents et des brouteurs, sont également limitées par les coûts de main-d’œuvre car elles reposent sur l’élimination ou l’exclusion manuelle sous l’eau de ces facteurs de stress biotiques¹¹. La technique du « gravier vert » surmonte ces limites grâce à un déploiement simple depuis la surface, ne nécessitant aucune installation sous-marine ni connaissances techniques et une évolutivité à des coûts relativement faibles²⁸. Cette approche innovante fournit un outil de restauration prometteur, incitant à des essais approfondis dans divers lieux et environnements pour libérer tout son potentiel³².

Bien que des efforts de restauration réussis avec du « gravier vert » aient été documentés dans des fjords abrités de Norvège à l’aide du varech sucré, Saccharina latissima²⁶, cette technique est encore en phase pilote pour Macrocystis pyrifera dans le Pacifique oriental. D’autres essais sont nécessaires pour déterminer la survie attendue des plantes plantaires de M. pyrifera dans son aire de répartition. Dans des conditions d’exposition aux vagues typiques de la croissance de M. pyrifera , le gravier plus petit peut être plus sujet au mouvement et à l’abrasion, ce qui endommage les semis. De plus, la flottabilité positive fournie par les pneumatocystes remplis de gaz de M. pyrifera peut entraîner l’emport efficace des plantes de « gravier vert » hors du site de restauration, et par conséquent, la taille et le poids du gravier sont des facteurs importants à explorer pour cette espèce. Dans une étude pilote récente (mai 2022 ; Ensenada, Basse-Californie, Mexique), un succès préliminaire sur le terrain avec M. pyrifera a été observé, indiqué par l’attachement des haptera au substrat environnant et la croissance des juvéniles atteignant 1,2 m de longueur après deux mois sur le terrain (figure 4). Cela démontre une opportunité claire qui n’a pas encore été explorée dans l’utilisation du « gravier vert » pour M. pyrifera dans le Pacifique oriental. Cette vidéo présente la technique du « gravier vert » avec M. pyrifera et constitue une ressource précieuse qui simplifie et centralise les pratiques existantes dans la phase de culture de la restauration pour soutenir les études qui traitent des succès et des limites dans différents contextes de terrain.

Avec la technique du « gravier vert », de nombreuses petites unités de gravier individuelles peuvent être ensemencées à une échelle qui peut augmenter la probabilité de succès par rapport aux approches de transplantation plus courantes avec des plantes adultes. Cependant, l’aspect évolutif clé de cette technique est son déploiement simple depuis la surface, ce qui peut faciliter la restauration de grandes surfaces par bateau. Pour les environnements de terrain où le déploiement de petits graviers ne convient pas, ce protocole peut être adapté pour transplanter M. pyrifera sur une large gamme de substrats, y compris des graviers plus gros ou même de petits rochers, des ficelles qui peuvent être attachées à des ancres sous-marines naturelles ou déployées, ou des tuiles qui peuvent être boulonnées ou collées à l’aide d’époxy marin au fond marin dans des conditions plus exposées. Ces adaptations de déploiement ne modifieront pas les installations nécessaires à l’élevage de M. pyrifera , mais augmenteront par la suite le coût du déploiement.

Les perturbations anthropiques et les changements climatiques ont actuellement à bout la capacité d’adaptation des populations naturelles. Cela pose des défis importants aux efforts de conservation traditionnels qui restaurent les écosystèmes dans leur état historique 58,59,60,61,62,63. Ainsi, les cadres de conservation se sont élargis pour inclure une gestion anticipative tenant compte de la résilience et de la capacité d’adaptation⁶⁴. Une gestion anticipée pour faire face au changement climatique est mise en œuvre pour les espèces d’arbres dans les écosystèmes forestiers⁶⁵ et a été proposée pour d’autres efforts de restauration afin d’améliorer le potentiel évolutif des plantes plantées ^66,67. Bien que ces stratégies soient intrinsèquement plus faciles à manipuler dans les environnements terrestres, plusieurs études commencent à explorer leur application dans les environnements marins 62,68,69,70. Par exemple, les récifs coralliens sont menacés par de nombreux facteurs de stress anthropiques qui ont entraîné des déclins sans précédent^71,72. En réponse à la perte de ces espèces fondamentales importantes, la restauration active et les techniques d’adaptation assistée sont de plus en plus préconisées pour conserver les récifs coralliens restants et leurs fonctions associées 62,73,74. Une technique consiste à déplacer des individus dans leur aire de répartition actuelle pour augmenter la tolérance au stress thermique⁷⁵. En ce qui concerne la restauration des varechs formant la canopée, le « gravier vert » dispose d’un cadre personnalisable pour explorer des techniques d’adaptation assistée telles que la translocation de génotypes résilients dans des zones vulnérables, la manipulation non génétique telle que l’hybridation ou l’acclimatation des individus au stress environnemental⁶² avec des résultats visant à obtenir des souches plus résistantes pour les programmes de restauration^76,77.

Il est essentiel d’exploiter le soutien local pour améliorer les efforts de restauration afin de maintenir le succès de la conservation de l’écosystème du varech. La participation des intervenants locaux peut accroître l’adhésion locale aux besoins de restauration ^6,50 et promouvoir l’intendance côtière, ce qui pourrait par la suite entraîner une augmentation du financement et de la longévité de la protection de l’écosystème du varech. Comme pour toutes les autres méthodologies de restauration du varech, des cadres décisionnels structurés intégrant divers objectifs écologiques, socioéconomiques et de conservation aideront à obtenir des résultats optimaux pour les écosystèmes de varech et les communautés qu’ils soutiennent¹¹.

Materials

0.22 µm filters	Milipore	SCGPS05RE	Natural seawater sterilization
1 L glass bottles	Amazon	B07J6JP4D1	Natural seawater sterilization
1 µm filters (water + air)	Amazon	B01M1VWUWL	Natural seawater sterilization
1'' PVC 90-Degree Elbow	Home Depot	203812125	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
10 µm filters	Amazon	B00D04BG56	Natural seawater sterilization
20 µm filters	Amazon	B082WS9NPH	Natural seawater sterilization
3x5mm tubing	Amazon	B0852HXPN6	Option 1 Small scale – Incubator
4×4'' Sterile Gauze	Amazon	B07NDK8XM3	Sporulation
4x6mm tubing	Amazon	B08BCRV1FY	Option 1 Small scale – Incubator
5 µm filters	Amazon	B082WS9NPH	Natural seawater sterilization
50 mL falcon tubing	Amazon	B01M04HGPJ	Sporulation
8x10mm tubing	Amazon	B01MSM3LLZ	Option 1 Small scale – Incubator
Air filters	Thermo Fisher	MTGR85010	Option 1 Small scale – Incubator
Alcohol lamp	Amazon	B07XWD9WWC	Sporulation
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate ACS reagent, 99%	Sigma	215406-100G	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Aquarium Grade Gravel	Amazon	B07XRCKFBJ	Option 1 Small scale – Incubator
Biotin powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, 99%	Sigma	B4639-100MG	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Boric Acid, 99.8%, 10043-35-3, MFCD00011337, BH3O3, 61.83, 500g	Thermo Fisher	5090113707	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Calcium D-Pantothenate,ge98.0% (T),C9H17NO5,137-08-6,25g,D-Pantothenic Acid Calcium Salt, P0012-25G 1/EA	Thermo Fisher	P001225G	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Check valves	Amazon	B08HRZR4MM	Option 1 Small scale – Incubator
Clear tubing 3/8'' – 10 ft	Amazon	B07MTYMW13	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
COBALT(II) SULFATE HEPTAH-100G, WARNING – California – Cancer Hazard, 93-2749-100G 1/EA	Thermo Fisher	5090114752	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Compound microscope with camera	OMAX	M83EZ-C50S	Monitoring
Culture flask	Thermo Fisher	07-250-080	Option 1 Small scale – Incubator
Culture light	Amazon	B07RRRPJ63	Option 1 Small scale – Incubator
Culture stoppers	Amazon	B07DX6J7QD	Option 1 Small scale – Incubator
Drainage connector	Amazon	B00GUZ6CV0	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
EDTA CAS Number: 6381-92-6 Molecular Formula: C10H14N2O8Na2- 2H2O Molecular Weight: 372.2	Thermo Fisher	50213299	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Eisco Safety Pack Graduated Cylinder Sets Class A, ASTM, Capacity: 10 mL, 25 mL, 50 mL, Graduations: 0.2 mL, 0.5 mL, 1.0 mL, Borosilicate 3.3 Glass, Autoclavable: Yes, Class: Class A, Graduated: Yes, Tolerance: 0.10 mL, 0.17 mL, 0.25 mL	Thermo Fisher	S81273	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Eisco Safety Pack Graduated Cylinder Sets Class A, ASTM, Capacity: 50 mL, 100 mL, 250 mL, Graduations: 1.0 mL, 1.0 mL, 2.0 mL, Borosilicate 3.3 Glass, Autoclavable: Yes, Class: Class A, Graduated: Yes, Tolerance: 0.25 mL, 0.50 mL, 1.0 mL	Thermo Fisher	S81275	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Eisco Safety Pack Volumetric Flask Sets – Class A, ASTM, Capacity: 10 mL, 25 mL, 50 mL, Borosilicate 3.3 Glass, Autoclavable: Yes, Class: Class A, Closure Material: Glass, Closure Size: Stopper Number: 9, 9, 13, Closure Type: Penny Stopper, Graduated: Ye	Thermo Fisher	S81271	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Filter holder	Amazon	B07LCKBKCT	Natural seawater sterilization
Fisherbrand Graduated Cylinders, Capacity: 500 mL, Graduations: 5 mL, Borosilicate Glass, Autoclavable: Yes, Limit of Error: +/-4.0 mL, Recommended Applications: Education, Subdivision: 5 mL, S63460 1/EA	Thermo Fisher	S63460	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
FLEXACAM C1 Camera	Leica	FLEXACAM C1	Monitoring
Folic acid, C19H19N7O6, CAS Number59303, vitamin m, pteroylglutamic acid, vitamin b9, folvite, folacin, folacid, pteroyllglutamic acid, pteglu, folic acid, folate, 25g, 100781, CHEBI:27470, Yellow to Orange, 2004190, 441.41, OVBPIULPVIDEAOLBPRGKRZSAN	Thermo Fisher	AAJ6083314	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Free Standing 20 Gallon Utility Sink	Amazon	B094TLH19L	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
GERMANIUM DIOXIDE 99.99 10GR	Thermo Fisher	AC190000100	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Glass Graduated Cylinders, Class A Round Base, Eisco, For Use With: Measuring liquids, Capacity: 1000 mL, Graduations: 10 mL White, CH0344OWT 1/EA	Thermo Fisher	S88442	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Glass slides	Amazon	B00L1S93PS	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Glycerol phosphate disodium salt hydrate isomeric mixture	Sigma	G6501-100G	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Growth containers -3.4 Qt- 3.25 Lt transparent containers with transparent lid	Container store	#10014828	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Growth light	Amazon	B086R14MFW	Option 1 Small scale – Incubator
Hemocytometer	Amazon	B07TJQDKLJ	Sporulation
HEPES 99.5% (titration)	Sigma	H3375-500G	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Hinged plastic jars	SKS Bottle & Packaging	40280125.01S	Option 1 Small scale – Incubator
Inositol research grade, USP/NF For bacteriology. Optically inactive. Tested for its suitability in tissue culture. Size – 100G Storage Conditions – +15 C TO +30 C Catalog Number – 26310.01 CAS 87-89-8	Thermo Fisher	50247745	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Instant Ocean – 50 G	Amazon	B000255NKA	Option 1 Small scale – Incubator
Inverted Microscope Leica DMi1	Leica	DMi1	Monitoring
Iron(III) chloride hexahydrate ACS reagent, 97%	Sigma	236489-100G	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Licor Ligth Meter Data Logger	Licor	LI-250A	Monitoring
Light/temperature HOBO data logger	Amazon	B075X2SWKN	Monitoring
Lights 150W	Amazon	B0799DQM9V	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Manganese sulfate monohydrate meets USP testing specifications	Sigma	M8179-100G	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Medium size rocks 2-3 inch, 20 pounds	Home Depot	206823930	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Nicotinic Acid, 99%, C6H5NO2, CAS Number59676, daskil, apelagrin, acidum nicotinicum, akotin, 3carboxypyridine, niacin, 3pyridinecarboxylic acid, nicotinic acid, pellagrin, wampocap, 250g, 109591, CHEBI:15940, 1.4, 2004410, 293 deg.C (559 deg.F), 123.11,	Thermo Fisher	AAA1268330	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
p-Aminobenzoic acid 99.82% 4-aminobenzoic acid, C7H7NO2, CAS Number: 150-13-0, 25g, 0210256925 1/EA	Thermo Fisher	ICN10256925	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
PCV cement	Amazon	B001D9WRWG	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Plastic water valve	Amazon	B0006JLVE4	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Plastic water valve	Amazon	B07G5FY7X1	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Precision scale 1mg	Amazon	B08DTH95FN	Materials to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Pump for filtered air	Amazon	B0BG2BT9RX	Option 1 Small scale – Incubator
PVC tubing 1×24''	Home Depot	202300505	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Quantum Light meter	Apogee Instruments	MQ-510	Monitoring
Refrigerated Incubator	Thermo Fisher	15-103-1566	Option 1 Small scale – Incubator
Rubber Grommets	Amazon	B07YZD22ZP	Option 1 Small scale – Incubator
Salinity refractometer	ATC	B018LRO1SU	Monitoring
Shade mesh 6×50 ft	Home depot	316308418	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Sodium Nitrate ge 99.0% Nitric Acid, Sodium Salt, NNaO3, CAS Number: 7631-99-4, 500g, 1/EA	Thermo Fisher	BP360500	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Soldering for aeration opening	Amazon	B08R3515SF	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Spray isporopyl alcohol	Amazon	‎ B08LW5P844	Sporulation
Stainless steel sissors	Amazon	B07BT4YLHT	Sporulation
Stainless steel tray	Amazon	B08CV33YXG	Sporulation
Stainless steel twizzers	Amazon	B01JTZTAJS	Sporulation
Stir Bars	Amazon	B07C4TNKXB	Materials to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Submersible circulation pump 400 GPH	Amazon	B07RZKRM13	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Submersible Spherical Quantum Sensor	Waltz	US-SQS/L	Monitoring
Temperature gun	Infrared Thermometer 749	B07VTPJXH9	Monitoring
Thiamine hydrochloride BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture	Sigma	T1270-25G	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Thymine 99% 2, 4-Dihydroxy-5-methylpyrimidine, C5H6N2O2, CAS Number: 65-71-4, 25g, 157850250 1/EA	Thermo Fisher	AC157850250	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Transparent Acrylic sheet 24×48 inch	Home Depot	202038048	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Tubing water circulation 1''x10 ft	Amazon	B07ZC1PSF3	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
UV light for natural seawater sterilization	Amazon	B018OI7PYS	Natural seawater sterilization
Vacum pump	Amazon	B087XBTPVW	Natural seawater sterilization
Vitamin B12 BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, 98%	Sigma	V6629-100MG	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Volumetric Flasks, Class A Glass, Eisco, with Polypropylene Stopper, Graduated, White printed markings, Capacity: 1000 mL, CH0446IWT 1/EA	Thermo Fisher	S89446	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Volumetric Flasks, Class A Glass, Eisco, with Polypropylene Stopper, Graduated, White printed markings, Capacity: 500 mL, CH0446HWT 1/EA	Thermo Fisher	S89445	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Water Chiller 200-600GPM	Amazon	B07BHHP71C	Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Y-splitters for 4x6mm tubing	Amazon	B08XTJKFCH	Option 1 Small scale – Incubator
Zinc sulfate heptahydrate BioReagent, suitable for cell culture	Sigma	Z0251-100G	Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment