Etablierung und Charakterisierung von patienteneigenen Magenorganoiden aus Biopsien des gutartigen Magenkörpers und des Antralepithels

Summary

Aus Magenpatienten stammende Organoide finden zunehmend Verwendung in der Forschung, jedoch fehlen formale Protokolle zur Erzeugung menschlicher Magenorganoide aus Einzelzellverdauen mit standardisierter Aussaatdichte. Dieses Protokoll stellt eine detaillierte Methode zur zuverlässigen Herstellung von Magenorganoiden aus Biopsiegewebe dar, das während der oberen Endoskopie gewonnen wurde.

Abstract

Magenpatienten-abgeleitete Organoide (PDOs) bieten ein einzigartiges Werkzeug für die Untersuchung der Magenbiologie und -pathologie. Folglich finden diese g.U. zunehmend Verwendung in einer Vielzahl von Forschungsanwendungen. Es gibt jedoch einen Mangel an veröffentlichten Ansätzen zur Herstellung von Magen-PDOs aus Einzelzellverdauen unter Beibehaltung einer standardisierten anfänglichen Zellaussaatdichte. In diesem Protokoll liegt der Schwerpunkt auf der Initiierung von Magenorganoiden aus isolierten Einzelzellen und der Bereitstellung einer Methode zur Passage von Organoiden durch Fragmentierung. Wichtig ist, dass das Protokoll zeigt, dass ein standardisierter Ansatz für die anfängliche Zellaussaatdichte konsistent Magenorganoide aus gutartigem Biopsiegewebe liefert und eine standardisierte Quantifizierung des Organoidwachstums ermöglicht. Schließlich gibt es Hinweise auf die neue Beobachtung, dass Magen-PDOs unterschiedliche Bildungs- und Wachstumsraten aufweisen, je nachdem, ob die Organoide aus Biopsien des Körpers oder aus Antralregionen des Magens stammen. Insbesondere wird gezeigt, dass die Verwendung von Antralbiopsiegewebe für die Organoidinitiierung zu einer größeren Anzahl von Organoiden und einem schnelleren Wachstum von Organoiden über einen Zeitraum von 20 Tagen im Vergleich zu Organoiden führt, die aus Biopsien des Magenkörpers erzeugt werden. Das hierin beschriebene Protokoll bietet Forschern eine zeitnahe und reproduzierbare Methode zur erfolgreichen Erzeugung und Arbeit mit Magen-PDOs.

Introduction

Organoide sind dreidimensionale (3D) zelluläre Miniaturstrukturen, die der Architektur und Funktionalität der Organe ähneln, von denen sie abgeleitet wurden ^1,2. Diese im Labor gezüchteten Modelle werden durch die Kultivierung von Stammzellen oder gewebespezifischen Zellen in einer kontrollierten Umgebung hergestellt, die es diesen Zellen ermöglicht, sich selbst zu organisieren und in verschiedene Zelltypen zu differenzieren ^1,2,3. Einer der Hauptvorteile von Organoiden ist ihre Fähigkeit, die menschliche Biologie genauer zu rekapitulieren als herkömmliche zweidimensionale (2D) Zellkulturen ^1,2,3. Insbesondere hat sich gezeigt, dass menschliche Organoide die genetische Vielfalt ihres Ursprungsgewebes erhalten ^3,4,5. Organoide bieten eine einzigartige Möglichkeit, die Entwicklung menschlicher Organe zu untersuchen, Krankheiten zu modellieren und potenzielle Therapeutika in einer kontrollierten Laborumgebung zu testen. Darüber hinaus können Organoide aus individuellen Patientenproben abgeleitet werden, was Ansätze der personalisierten Medizin und die potenzielle Entwicklung individualisierter Behandlungen ermöglicht ^3,6,7.

Forscher haben menschliche Magenorganoide verwendet, um verschiedene Aspekte der Magenbiologie und -pathologie zu untersuchen. Prominente Beispiele sind die Verwendung von patientenabgeleiteten Organoiden (PDOs) zur Vorhersage des Ansprechens auf eine Chemotherapie bei Magenkrebs ^8,9,10 und zur Modellierung der epithelialen Reaktion auf eine Helicobacter-pylori-Infektion ^11,12,13. Menschliche Magenorganoide bestehen aus verschiedenen Zelltypen, die im Magen vorkommen, darunter Halszellen, Grubenzellen und andere Stützzellen^11,14. Magenorganoide können entweder aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) oder direkt aus Magengewebe isoliert werden, das durch Biopsien gewonnen wurde, oder aus Magenresektionsproben^11,14. Die Isolierung von Magenstammzellen aus Magengewebe erfolgt üblicherweise durch Isolierung und Kultivierung von Magendrüsen oder enzymatisch verdauliche Gewebeproben zur Freisetzung einzelner Zellen ^9,13,15. Wichtig ist, dass sich die Differenzierung von Zellen innerhalb von Magenorganoiden, die mit einer dieser Techniken erzeugt wurden, als ähnlich erwiesen hat¹³. Das hier beschriebene Protokoll konzentriert sich auf einen Einzelzellverdau.

Organoide stellen eine wissenschaftliche Innovation dar, die die Lücke zwischen traditioneller Zellkultur und ganzen Organen schließt. Da die Forschung auf diesem Gebiet weiter voranschreitet, sind Organoide bereit, zur Entwicklung wirksamerer Behandlungen und Therapien für eine Vielzahl von Anwendungen beizutragen. Angesichts der zunehmenden Nutzung von Magen-PDOs besteht ein zeitgemäßer Bedarf an einem standardisierten Ansatz für ihre Erzeugung. Hier wird das Protokoll zur Generierung menschlicher Magen-PDOs aus Einzelzellen beschrieben, die aus gutartigem Magenbiopsiegewebe isoliert wurden, das während der oberen Endoskopie gewonnen wurde. Wichtig und einzigartig ist, dass eine standardisierte Anzahl von Einzelzellen für die Aussaat bestimmt wird, um zuverlässig Magen-PDOs zu erzeugen und eine anschließende Charakterisierung zu ermöglichen. Mit dieser Technik werden zuverlässige Unterschiede in der Bildung und dem Wachstum von Organoiden nachgewiesen, die aus Biopsien des Magenkörpers oder des Magenantrums generiert wurden.

Protocol

Sämtliches menschliches Gewebe, das in diesem Protokoll verwendet wurde, wurde von Personen gesammelt, die im Rahmen einer vom University of Pennsylvania Institutional Review Board (IRB #842961) genehmigten Magengewebeentnahmestudie eine informierte Einwilligung zur Gewebeentnahme erteilt hatten. Die Teilnehmer dieser Studie mussten sich im Rahmen ihrer Routineversorgung einer oberen Endoskopie unterziehen, mindestens 18 Jahre alt sein und in der Lage sein, eine informierte Einwilligung zu geben. Alle durchgeführten Un…

Representative Results

Die anschließenden repräsentativen Ergebnisse stammen aus Biopsien, die aus dem gutartigen Epithel des Magenkörpers und der Magenantrumregionen von fünf verschiedenen Patienten entnommen wurden, die sich einer oberen Endoskopie unterzogen. Pro Patient wurden zwei bis vier “Kuppeln”/Wells plattiert und sowohl für Magenkörper- als auch für Antrumbiopsien analysiert. Organoide wurden erfolgreich aus dem Magenkörper und dem Magenantrumbiopsiegewebe von allen fünf Patienten generiert. Im Durchschnitt wurden 41 Organo…

Discussion

Hier wird ein detailliertes Protokoll zur zuverlässigen Erzeugung menschlicher Magenorganoide aus Einzelzellen beschrieben, die aus Biopsien von gutartigem Epithel aus dem Magenkörper und dem Antrum isoliert wurden. Kritische Schritte im Protokoll drehen sich um das Timing sowie den Umgang mit der Basalmembranmatrix. Um die Lebensfähigkeit zu erhalten, ist es wichtig, das Protokoll so schnell wie möglich nach der Entnahme des Biopsiegewebes einzuleiten. Ziel ist es, innerhalb von 30 Minuten nach der Biopsie mit der V…

Materials

0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
A83-01	R&D Systems	2939
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
Amphotericin B	Invitrogen	15290018
B27	Invitrogen	17504044
BZ-X710	Keyence	n/a
cellSens	Olympus	n/a
Collagenase III	Worthington	LS004182
Dispase II	Sigma	D4693-1G
Dithiothreitol (DTT)	EMSCO/Fisher	BP1725
DPBS	Gibco	14200-075
Fungin	InvivoGen	NC9326704
Gastrin I	Sigma Aldrich	G9145
Gentamicin	Invitrogen	1570060
Glutamax	Gibco	35050-061
hEGF	Peprotech	AF-100-15
HEPES	Invitrogen	15630080
hFGF-10	Peprotech	100-26
L-WRN Cell Line	ATCC	CRL-3276
Matrigel	Corning	47743-715
Metronidazole	MP Biomedicals	155710
N2 Supplement	Invitrogen	17502048
Noggin ELISA Kit	Novus Biologicals	NBP2-80296
Pen Strep	Gibco	15140-122
RPMI 1640	Gibco	11875-085
R-Spondin ELISA Kit	R&D Systems	DY4120-05
Wnt-3a ELISA Kit	R&D Systems	DY1324B-05
Y-27632	Sigma Aldrich	Y0503