Costituzione e caratterizzazione di organoidi gastrici derivati da pazienti da biopsie del corpo gastrico benigno e dell'epitelio antrale

Summary

Gli organoidi derivati da pazienti gastrici trovano un uso crescente nella ricerca, ma mancano protocolli formali per la generazione di organoidi gastrici umani da digest a singola cellula con densità di semina standardizzata. Questo protocollo presenta un metodo dettagliato per creare in modo affidabile organoidi gastrici da tessuto bioptico ottenuto durante l’endoscopia superiore.

Abstract

Gli organoidi gastrici derivati da pazienti (PDO) offrono uno strumento unico per lo studio della biologia e della patologia gastrica. Di conseguenza, questi DOP trovano un uso crescente in un’ampia gamma di applicazioni di ricerca. Tuttavia, esiste una carenza di approcci pubblicati per la produzione di PDO gastrici da digest di singole cellule, mantenendo una densità di semina cellulare iniziale standardizzata. In questo protocollo, l’enfasi è posta sull’inizio di organoidi gastrici da singole cellule isolate e sulla fornitura di un metodo per il passaggio di organoidi attraverso la frammentazione. È importante sottolineare che il protocollo dimostra che un approccio standardizzato alla densità iniziale di semina cellulare produce costantemente organoidi gastrici da tessuto bioptico benigno e consente una quantificazione standardizzata della crescita degli organoidi. Infine, l’evidenza supporta la nuova osservazione che i PDO gastrici mostrano tassi variabili di formazione e crescita in base al fatto che gli organoidi provengano da biopsie del corpo o dalle regioni antrali dello stomaco. In particolare, è stato rivelato che l’uso del tessuto della biopsia antrale per l’inizio dell’organoide si traduce in un maggior numero di organoidi formati e in una crescita più rapida degli organoidi in un periodo di 20 giorni rispetto agli organoidi generati dalle biopsie del corpo gastrico. Il protocollo qui descritto offre ai ricercatori un metodo tempestivo e riproducibile per generare e lavorare con successo con i PDO gastrici.

Introduction

Gli organoidi sono strutture cellulari tridimensionali (3D) in miniatura che assomigliano all’architettura e alla funzionalità degli organi da cui sono stati derivati ^1,2. Questi modelli coltivati in laboratorio sono creati coltivando cellule staminali o cellule tessuto-specifiche in un ambiente controllato che consente a queste cellule di auto-organizzarsi e differenziarsi in vari tipi di cellule ^1,2,3. Uno dei principali vantaggi degli organoidi è la loro capacità di ricapitolare la biologia umana in modo più accurato rispetto alle tradizionali colture cellulari bidimensionali (2D) ^1,2,3. In particolare, è stato dimostrato che gli organoidi umani mantengono la diversità genetica del loro tessuto di origine ^3,4,5. Gli organoidi offrono un’opportunità unica per studiare lo sviluppo degli organi umani, modellare le malattie e testare potenziali terapie in un ambiente di laboratorio controllato. Inoltre, gli organoidi possono essere derivati da campioni di singoli pazienti, consentendo approcci di medicina personalizzata e il potenziale sviluppo di trattamenti individualizzati ^3,6,7.

I ricercatori hanno utilizzato organoidi gastrici umani per studiare vari aspetti della biologia e della patologia gastrica. Esempi importanti includono l’uso di organoidi derivati da pazienti (PDO) per prevedere le risposte alla chemioterapia del cancro gastrico ^8,9,10 e modellare la risposta epiteliale all’infezione da Helicobacter pylori 11,12,13. Gli organoidi gastrici umani sono costituiti da vari tipi di cellule presenti nello stomaco, tra cui cellule del collo, cellule della fossa e altre cellule di supporto^11,14. Gli organoidi gastrici possono essere generati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) o da cellule staminali direttamente isolate dal tessuto gastrico ottenuto tramite biopsie o da campioni di resezione gastrica^11,14. L’isolamento delle cellule staminali gastriche dal tessuto gastrico viene comunemente effettuato isolando e colturando le ghiandole gastriche o digerendo enzimaticamente campioni di tessuto per liberare singole cellule ^9,13,15. È importante sottolineare che la differenziazione delle cellule all’interno degli organoidi gastrici generati utilizzando una di queste tecniche ha dimostrato di essere simile¹³. Il protocollo qui descritto si concentra su un digest a singola cellula.

Gli organoidi rappresentano un’innovazione scientifica che colma il divario tra la coltura cellulare tradizionale e gli organi interi. Man mano che la ricerca in questo campo continua a progredire, gli organoidi sono pronti a contribuire allo sviluppo di trattamenti e terapie più efficaci per un’ampia gamma di applicazioni. Dato il crescente utilizzo di PDO gastriche, c’è una tempestiva necessità di un approccio standardizzato alla loro generazione. Qui viene descritto il protocollo per la generazione di PDO gastrici umane da singole cellule isolate da tessuto bioptico gastrico benigno acquisito durante l’endoscopia superiore. È importante sottolineare che viene determinato un numero standardizzato di singole cellule per la semina per generare in modo affidabile PDO gastrici e consentire la successiva caratterizzazione. Utilizzando questa tecnica, vengono dimostrate differenze affidabili nella formazione e nella crescita degli organoidi generati dalle biopsie del corpo gastrico o dell’antro gastrico.

Protocol

Tutto il tessuto umano utilizzato in questo protocollo è stato raccolto da individui che hanno fornito il consenso informato per la raccolta di tessuti attraverso uno studio di raccolta di tessuto gastrico approvato dall’Institutional Review Board dell’Università della Pennsylvania (IRB #842961). Ai partecipanti a questo studio è stato richiesto di sottoporsi a un’endoscopia superiore come parte delle loro cure di routine, di avere almeno 18 anni ed essere in grado di fornire il consenso informato. Tutte le ricerche c…

Representative Results

I successivi risultati rappresentativi derivano da biopsie prelevate dall’epitelio benigno sia del corpo gastrico che dell’antro gastrico dello stomaco di cinque diversi pazienti sottoposti a endoscopia superiore. Da due a quattro “cupole”/pozzetti sono stati placcati e analizzati per paziente sia per le biopsie del corpo gastrico che per quelle dell’antro. Gli organoidi sono stati generati con successo dal corpo gastrico e dal tessuto bioptico dell’antro gastrico di tutti e cinque i pazienti. In media, sono stati analiz…

Discussion

In questo documento, viene delineato un protocollo dettagliato per generare in modo affidabile organoidi gastrici umani da singole cellule isolate da biopsie di epitelio benigno dal corpo gastrico e dall’antro. Le fasi critiche del protocollo ruotano attorno alla temporizzazione e alla gestione della matrice di membrana basale. Per preservare la vitalità, è essenziale avviare il protocollo il prima possibile dopo l’acquisizione del tessuto bioptico. L’obiettivo è quello di iniziare a digerire il tessuto bioptico entro…

Materials

0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
A83-01	R&D Systems	2939
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
Amphotericin B	Invitrogen	15290018
B27	Invitrogen	17504044
BZ-X710	Keyence	n/a
cellSens	Olympus	n/a
Collagenase III	Worthington	LS004182
Dispase II	Sigma	D4693-1G
Dithiothreitol (DTT)	EMSCO/Fisher	BP1725
DPBS	Gibco	14200-075
Fungin	InvivoGen	NC9326704
Gastrin I	Sigma Aldrich	G9145
Gentamicin	Invitrogen	1570060
Glutamax	Gibco	35050-061
hEGF	Peprotech	AF-100-15
HEPES	Invitrogen	15630080
hFGF-10	Peprotech	100-26
L-WRN Cell Line	ATCC	CRL-3276
Matrigel	Corning	47743-715
Metronidazole	MP Biomedicals	155710
N2 Supplement	Invitrogen	17502048
Noggin ELISA Kit	Novus Biologicals	NBP2-80296
Pen Strep	Gibco	15140-122
RPMI 1640	Gibco	11875-085
R-Spondin ELISA Kit	R&D Systems	DY4120-05
Wnt-3a ELISA Kit	R&D Systems	DY1324B-05
Y-27632	Sigma Aldrich	Y0503