Etablering og karakterisering af patientafledte gastriske organoider fra biopsier af godartet gastrisk krop og antralepitel

Summary

Gastrisk patientafledte organoider finder stigende anvendelse i forskning, men formelle protokoller til generering af humane gastriske organoider fra enkeltcellefordøjelser med standardiseret såtæthed mangler. Denne protokol præsenterer en detaljeret metode til pålideligt at skabe gastriske organoider fra biopsivæv opnået under øvre endoskopi.

Abstract

Gastrisk patientafledte organoider (PDO’er) tilbyder et unikt værktøj til at studere gastrisk biologi og patologi. Derfor finder disse BOB’er stigende anvendelse i en bred vifte af forskningsapplikationer. Der findes imidlertid mangel på offentliggjorte tilgange til fremstilling af gastriske BDO’er fra enkeltcellefordøjelser, samtidig med at der opretholdes en standardiseret indledende cellesåningstæthed. I denne protokol lægges der vægt på initiering af gastriske organoider fra isolerede enkeltceller og tilvejebringelse af en metode til overførsel af organoider gennem fragmentering. Det er vigtigt, at protokollen viser, at en standardiseret tilgang til den indledende cellesåningstæthed konsekvent giver gastriske organoider fra godartet biopsivæv og muliggør standardiseret kvantificering af organoidvækst. Endelig understøtter beviser den nye observation, at gastriske BDO’er viser varierende dannelses- og væksthastigheder baseret på, om organoiderne stammer fra biopsier i kroppen eller antrale områder i maven. Specifikt afsløres det, at brugen af antralbiopsivæv til organoidinitiering resulterer i et større antal dannede organoider og hurtigere organoidvækst over en 20-dages periode sammenlignet med organoider genereret fra biopsier i mavekroppen. Protokollen beskrevet heri tilbyder efterforskere en rettidig og reproducerbar metode til succesfuldt at generere og arbejde med gastriske BOB’er.

Introduction

Organoider er miniature tredimensionelle (3D) cellulære strukturer, der ligner arkitekturen og funktionaliteten af de organer, hvorfra de blev afledt ^1,2. Disse laboratoriedyrkede modeller er skabt ved at dyrke stamceller eller vævsspecifikke celler i et kontrolleret miljø, der gør det muligt for disse celler at selvorganisere og differentiere sig til forskellige celletyper ^1,2,3. En af de vigtigste fordele ved organoider er deres evne til at rekapitulere menneskelig biologi tættere end traditionelle todimensionelle (2D) cellekulturer ^1,2,3. Især har humane organoider vist sig at opretholde den genetiske mangfoldighed af deres oprindelsesvæv ^3,4,5. Organoider giver en unik mulighed for at studere menneskelig organudvikling, modellere sygdomme og teste potentielle behandlinger i en kontrolleret laboratorieindstilling. Desuden kan organoider udledes af individuelle patientprøver, hvilket muliggør personaliserede medicinmetoder og den potentielle udvikling af individualiserede behandlinger ^3,6,7.

Forskere har brugt humane gastriske organoider til at undersøge forskellige aspekter af gastrisk biologi og patologi. Fremtrædende eksempler omfatter brugen af patientafledte organoider (PDO’er) til at forudsige gastrisk kræft kemoterapi respons ^8,9,10 og model epitelresponset på Helicobacter pylori infektion 11,12,13. Humane gastriske organoider består af forskellige celletyper, der findes i maven, herunder nakkeceller, pitceller og andre støtteceller^11,14. Gastriske organoider kan enten genereres fra inducerede pluripotente stamceller (iPSC’er) eller stamceller direkte isoleret fra gastrisk væv opnået via biopsier eller fra gastriske resektionsprøver^11,14. Isolering af gastriske stamceller fra mavevæv udføres almindeligvis ved at isolere og dyrke mavekirtler eller enzymatisk fordøje vævsprøver for at frigøre enkeltceller ^9,13,15. Det er vigtigt, at differentieringen af celler inden for gastriske organoider genereret ved hjælp af en af disse teknikker har vist sig at være ens¹³. Protokollen beskrevet heri fokuserer på en enkeltcellefordøjelse.

Organoider repræsenterer en videnskabelig innovation, der bygger bro mellem traditionel cellekultur og hele organer. Da forskningen på området fortsætter med at udvikle sig, er organoider klar til at bidrage til udviklingen af mere effektive behandlinger og terapier til en bred vifte af applikationer. I betragtning af den stigende udnyttelse af gastriske BDO’er er der et rettidigt behov for en standardiseret tilgang til deres generation. Her beskrives protokollen til generering af humane gastriske BDO’er fra enkeltceller isoleret fra godartet gastrisk biopsivæv erhvervet under øvre endoskopi. Det er vigtigt og unikt, at et standardiseret antal enkeltceller bestemmes til såning for pålideligt at generere gastriske BDO’er og muliggøre efterfølgende karakterisering. Ved hjælp af denne teknik demonstreres pålidelige forskelle i dannelsen og væksten af organoider genereret fra biopsier af enten mavekroppen eller gastrisk antrum.

Protocol

Alt humant væv, der anvendes i denne protokol, blev indsamlet fra personer, der gav informeret samtykke til vævsindsamling gennem en gastrisk vævsindsamlingsundersøgelse godkendt af University of Pennsylvania Institutional Review Board (IRB # 842961). Deltagerne i denne undersøgelse skulle gennemgå en øvre endoskopi som en del af deres rutinemæssige pleje, være mindst 18 år gammel og være i stand til at give informeret samtykke. Al udført forskning overholdt retningslinjerne fra University of Pennsylvania.</p…

Representative Results

De efterfølgende repræsentative resultater stammer fra biopsier taget fra det godartede epitel i både mavekroppen og gastrisk antrumregioner i maven hos fem forskellige patienter, der gennemgår øvre endoskopi. To til fire “kupler” / brønde blev belagt og analyseret pr. Patient for både gastrisk krop og antrum biopsier. Organoider blev med succes genereret fra mavekroppen og gastrisk antrumbiopsivæv fra alle fem patienter. I gennemsnit blev 41 organoider analyseret pr. “kuppel” / brønd. Alle billeder er z-projekt…

Discussion

Heri skitseres en detaljeret protokol til pålidelig generering af humane gastriske organoider fra enkeltceller isoleret fra biopsier af godartet epitel fra mavekroppen og antrum. Kritiske trin i protokollen drejer sig om timing samt håndtering af kældermembranmatrixen. For at bevare levedygtigheden er det vigtigt at indlede protokollen så hurtigt som muligt efter erhvervelse af biopsivævet. Målet er at begynde at fordøje biopsivævet inden for 30 minutter efter, at biopsien er udført. Håndtering af kældermembra…

Materials

0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
A83-01	R&D Systems	2939
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
Amphotericin B	Invitrogen	15290018
B27	Invitrogen	17504044
BZ-X710	Keyence	n/a
cellSens	Olympus	n/a
Collagenase III	Worthington	LS004182
Dispase II	Sigma	D4693-1G
Dithiothreitol (DTT)	EMSCO/Fisher	BP1725
DPBS	Gibco	14200-075
Fungin	InvivoGen	NC9326704
Gastrin I	Sigma Aldrich	G9145
Gentamicin	Invitrogen	1570060
Glutamax	Gibco	35050-061
hEGF	Peprotech	AF-100-15
HEPES	Invitrogen	15630080
hFGF-10	Peprotech	100-26
L-WRN Cell Line	ATCC	CRL-3276
Matrigel	Corning	47743-715
Metronidazole	MP Biomedicals	155710
N2 Supplement	Invitrogen	17502048
Noggin ELISA Kit	Novus Biologicals	NBP2-80296
Pen Strep	Gibco	15140-122
RPMI 1640	Gibco	11875-085
R-Spondin ELISA Kit	R&D Systems	DY4120-05
Wnt-3a ELISA Kit	R&D Systems	DY1324B-05
Y-27632	Sigma Aldrich	Y0503