Vaststelling en karakterisering van van patiënten afgeleide maagorganoïden uit biopsieën van goedaardig maaglichaam en antraal epitheel
Summary
Organoïden die afkomstig zijn van maagpatiënten worden steeds vaker gebruikt in onderzoek, maar formele protocollen voor het genereren van menselijke maagorganoïden uit eencellige digesten met gestandaardiseerde zaaidichtheid ontbreken. Dit protocol presenteert een gedetailleerde methode voor het betrouwbaar maken van maagorganoïden uit biopsieweefsel dat is verkregen tijdens de bovenste endoscopie.
Abstract
Organoïden van maagpatiënten (BOB’s) bieden een uniek hulpmiddel voor het bestuderen van maagbiologie en pathologie. Deze BOB’s worden dan ook steeds vaker gebruikt in een breed scala aan onderzoekstoepassingen. Er bestaat echter een tekort aan gepubliceerde benaderingen voor het produceren van maag-BOB’s uit eencellige digesten met behoud van een gestandaardiseerde initiële celzaaidichtheid. In dit protocol ligt de nadruk op het initiëren van maagorganoïden uit geïsoleerde afzonderlijke cellen en het aanreiken van een methode om organoïden door fragmentatie te laten passeren. Belangrijk is dat het protocol aantoont dat een gestandaardiseerde benadering van de initiële dichtheid van het zaaien van cellen consequent maagorganoïden oplevert uit goedaardig biopsieweefsel en een gestandaardiseerde kwantificering van organoïdegroei mogelijk maakt. Ten slotte ondersteunt bewijs de nieuwe observatie dat maag-BOB’s verschillende vormings- en groeisnelheden vertonen, afhankelijk van het feit of de organoïden afkomstig zijn van biopsieën van het lichaam of antrale gebieden van de maag. In het bijzonder wordt onthuld dat het gebruik van antrale biopsieweefsel voor het initiëren van organoïden resulteert in een groter aantal gevormde organoïden en een snellere groei van organoïden over een periode van 20 dagen in vergelijking met organoïden die worden gegenereerd uit biopsieën van het maaglichaam. Het hierin beschreven protocol biedt onderzoekers een tijdige en reproduceerbare methode voor het succesvol genereren van en werken met maag-BOB’s.
Introduction
Organoïden zijn miniatuur driedimensionale (3D) cellulaire structuren die lijken op de architectuur en functionaliteit van de organen waarvan ze zijn afgeleid 1,2. Deze in het laboratorium gekweekte modellen worden gemaakt door stamcellen of weefselspecifieke cellen te kweken in een gecontroleerde omgeving die deze cellen in staat stelt zichzelf te organiseren en te differentiëren in verschillende celtypen 1,2,3. Een van de belangrijkste voordelen van organoïden is hun vermogen om de menselijke biologie nauwkeuriger te recapituleren dan traditionele tweedimensionale (2D) celculturen 1,2,3. In het bijzonder is aangetoond dat menselijke organoïden de genetische diversiteit van hun weefsel van oorsprong behouden 3,4,5. Organoïden bieden een unieke kans om de ontwikkeling van menselijke organen te bestuderen, ziekten te modelleren en potentiële therapieën te testen in een gecontroleerde laboratoriumomgeving. Bovendien kunnen organoïden worden afgeleid van individuele patiëntmonsters, waardoor gepersonaliseerde geneeswijzen en de mogelijke ontwikkeling van geïndividualiseerde behandelingen mogelijk worden 3,6,7.
Onderzoekers hebben menselijke maagorganoïden gebruikt om verschillende aspecten van maagbiologie en pathologie te onderzoeken. Prominente voorbeelden zijn het gebruik van van patiënten afgeleide organoïden (BOB’s) om de chemotherapierespons op maagkankerte voorspellen 8,9,10 en de epitheliale respons op Helicobacter pylori-infectie te modelleren 11,12,13. Menselijke maagorganoïden bestaan uit verschillende celtypen die in de maag worden aangetroffen, waaronder nekcellen, pitcellen en andere ondersteunende cellen 11,14. Maagorganoïden kunnen worden gegenereerd uit geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s) of stamcellen die rechtstreeks zijn geïsoleerd uit maagweefsel dat is verkregen via biopsieën of uit maagresectiemonsters11,14. Het isoleren van maagstamcellen uit maagweefsel wordt gewoonlijk gedaan door het isoleren en kweken van maagklieren of het enzymatisch verteren van weefselmonsters om afzonderlijke cellen vrij te maken 9,13,15. Belangrijk is dat is aangetoond dat de differentiatie van cellen in maagorganoïden die met een van deze technieken zijn gegenereerd, vergelijkbaar is13. Het hierin beschreven protocol richt zich op een eencellige digestie.
Organoïden vertegenwoordigen een wetenschappelijke innovatie die de kloof overbrugt tussen traditionele celkweek en hele organen. Naarmate het onderzoek in het veld vordert, staan organoïden klaar om bij te dragen aan de ontwikkeling van effectievere behandelingen en therapieën voor een breed scala aan toepassingen. Gezien het toenemende gebruik van maag-BOB’s, is er tijdig behoefte aan een gestandaardiseerde aanpak voor het genereren ervan. Hier wordt het protocol beschreven voor het genereren van BOB’s in de maag van de menselijke maag uit afzonderlijke cellen die zijn geïsoleerd uit goedaardig maagbiopsieweefsel dat is verkregen tijdens de bovenste endoscopie. Belangrijk en uniek is dat een gestandaardiseerd aantal afzonderlijke cellen wordt bepaald voor zaaien om op betrouwbare wijze maag-BOB’s te genereren en daaropvolgende karakterisering mogelijk te maken. Met behulp van deze techniek worden betrouwbare verschillen aangetoond in de vorming en groei van organoïden die worden gegenereerd uit biopsieën van het maaglichaam of maagantrum.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hierin wordt een gedetailleerd protocol geschetst voor het betrouwbaar genereren van menselijke maagorganoïden uit afzonderlijke cellen geïsoleerd uit biopsieën van goedaardig epitheel uit het maaglichaam en antrum. Kritieke stappen in het protocol draaien om timing en het hanteren van de basaalmembraanmatrix. Om de levensvatbaarheid te behouden, is het essentieel om het protocol zo snel mogelijk na het verkrijgen van het biopsieweefsel te starten. Het doel is om binnen 30 minuten na de biopsie te beginnen met het ver…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Universiteit van Pennsylvania Genomic Medicine T32 HG009495 (KHB), NCI R21 CA267949 (BWK), Men & BRCA-programma in het Basser Center for BRCA (KHB, BWK), DeGregorio Family Foundation Grant Award (BWK).
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| A83-01 | R&D Systems | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| BZ-X710 | Keyence | n/a | |
| cellSens | Olympus | n/a | |
| Collagenase III | Worthington | LS004182 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
| Dithiothreitol (DTT) | EMSCO/Fisher | BP1725 | |
| DPBS | Gibco | 14200-075 | |
| Fungin | InvivoGen | NC9326704 | |
| Gastrin I | Sigma Aldrich | G9145 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 1570060 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| hFGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| Matrigel | Corning | 47743-715 | |
| Metronidazole | MP Biomedicals | 155710 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| Noggin ELISA Kit | Novus Biologicals | NBP2-80296 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| R-Spondin ELISA Kit | R&D Systems | DY4120-05 | |
| Wnt-3a ELISA Kit | R&D Systems | DY1324B-05 | |
| Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 |
Riferimenti
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S. A brief history of organoids. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 319 (1), C151-C165 (2020).
- Zhao, Z., et al. Organoids. Nature Reviews Methods Primers. 2 (1), 94 (2022).
- Weeber, F., et al. Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (43), 13308-13311 (2015).
- Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
- Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
- Grönholm, M., et al. Patient-derived organoids for precision cancer immunotherapy. Cancer research. 81 (12), 3149-3155 (2021).
- Yan, H. H., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Yoon, C., et al. Patient-derived organoids from locally advanced gastric adenocarcinomas can predict resistance to neoadjuvant chemotherapy. Journal of Gastrointestinal Surgery. 27 (4), 666-676 (2023).
- Miao, X., et al. Establishment of gastric cancer organoid and its application in individualized therapy. Oncology Letters. 24 (6), 1-8 (2022).
- Pompaiah, M., Bartfeld, S. Gastric organoids: an emerging model system to study Helicobacter pylori pathogenesis. Molecular Pathogenesis and Signal Transduction by Helicobacter pylori. 400, 149-168 (2017).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Seidlitz, T., Koo, B. K., Stange, D. E. Gastric organoids-an in vitro model system for the study of gastric development and road to personalized medicine. Cell Death & Differentiation. 28 (1), 68-83 (2021).
- Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as model for infectious diseases: culture of human and murine stomach organoids and microinjection of Helicobacter pylori. Journal of Visualized Experiments. 105, e53359 (2015).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Yang, H. J., et al. Sample collection methods in upper gastrointestinal research. Journal of Korean Medical Science. 38 (32), e255 (2023).
- Kim, S., et al. Comparison of cell and organoid-level analysis of patient-derived 3D organoids to evaluate tumor cell growth dynamics and drug response. SLAS DISCOVERY: Advancing the Science of Drug Discovery. 25 (7), 744-754 (2020).
- Maru, Y., Tanaka, N., Itami, M., Hippo, Y. Efficient use of patient-derived organoids as a preclinical model for gynecologic tumors. Gynecologic Oncology. 154 (1), 189-198 (2019).
- McGowan, K. P., Delgado, E., Hibdon, E. S., Samuelson, L. C. Differential sensitivity to Wnt signaling gradients in human gastric organoids derived from corpus and antrum. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 325 (2), G158-G173 (2023).
- Busslinger, G. A., et al. Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution. Cell Reports. 34 (10), 108819 (2021).
- Yang, R., et al. A quick and reliable image-based AI algorithm for evaluating cellular senescence of gastric organoids. Cancer Biology & Medicine. 20 (7), 519 (2023).
- Skubleny, D., et al. Murine and Human gastric tissue establishes organoids after 48 hours of cold ischemia time during shipment. Biomedicines. 11 (1), 151 (2023).
