良性胃体および外皮上皮の生検からの患者由来胃オルガノイドの確立と特性評価
Summary
胃患者由来オルガノイドは研究での利用が増加しているが、標準化された播種密度を持つ単一細胞消化物からヒト胃オルガノイドを生成するための正式なプロトコルが不足している。このプロトコルは、上部内視鏡検査中に得られた生検組織から胃オルガノイドを確実に作成するための詳細な方法を提示します。
Abstract
胃患者由来オルガノイド(PDO)は、胃の生物学と病理学を研究するためのユニークなツールを提供します。その結果、これらのPDOは、幅広い研究用途での使用が増加しています。しかし、標準化された初期細胞播種密度を維持しながら、単一細胞消化物から胃PDOを産生するための公表されたアプローチは不足しています。このプロトコルでは、重点は隔離された単一細胞からの胃のオルガノイドの開始および分裂によってオルガノイドを継代の方法の提供にある。重要なことに、このプロトコルは、最初の細胞播種密度への標準化されたアプローチが、良性の生検組織から胃オルガノイドを一貫して生成し、オルガノイド増殖の標準化された定量化を可能にすることを示しています。最後に、胃PDOは、オルガノイドが体の生検に由来するか、胃の胞状領域に由来するかに基づいて、さまざまな形成速度と増殖速度を示すという新しい観察結果を裏付ける証拠があります。具体的には、オルガノイド開始に門生検組織を使用すると、胃本体の生検から生成されたオルガノイドと比較して、より多くのオルガノイドが形成され、20日間にわたってオルガノイドの成長が速くなることが明らかになりました。本明細書に記載されているプロトコルは、研究者に胃PDOを正常に生成および操作するためのタイムリーで再現性のある方法を提供します。
Introduction
オルガノイドは、オルガノイドの元となった器官の構造や機能に似た、ミニチュアの3次元(3D)細胞構造です1,2。これらのラボで培養されたモデルは、幹細胞または組織特異的細胞を制御された環境で培養することによって作成され、これらの細胞が自己組織化してさまざまな細胞型に分化できるようにします1,2,3。オルガノイドの主な利点の1つは、従来の2次元(2D)細胞培養よりもヒトの生物学をより詳細に再現できることです1,2,3。特に、ヒトオルガノイドは、その起源組織の遺伝的多様性を維持することが示されている3,4,5。オルガノイドは、ヒトの臓器発生を研究し、疾患をモデル化し、制御された実験室環境で潜在的な治療法をテストするユニークな機会を提供します。さらに、オルガノイドは個々の患者サンプルから誘導できるため、個別化医療のアプローチと個別化治療の開発の可能性が可能になります3,6,7。
研究者は、ヒト胃オルガノイドを使用して、胃の生物学と病理学のさまざまな側面を調査してきました。顕著な例としては、患者由来オルガノイド(PDO)を使用して胃がんの化学療法反応を予測し8,9,10、ヘリコバクター・ピロリ感染に対する上皮反応をモデル化することが挙げられます11,12,13。ヒト胃オルガノイドは、頸部細胞、ピット細胞、その他の支持細胞など、胃に見られるさまざまな種類の細胞で構成されています11,14。胃オルガノイドは、人工多能性幹細胞(iPS細胞)から作製するか、生検で得られた胃組織から直接単離された幹細胞、または胃切除標本から作製することができる11,14。胃組織からの胃幹細胞の単離は、通常、胃腺を単離して培養するか、組織サンプルを酵素的に消化して単一細胞を遊離することによって行われます9,13,15。重要なことに、これらの技術のいずれかを使用して生成された胃オルガノイド内の細胞の分化は、類似していることが示されています13。本明細書に記載のプロトコールは、単一細胞消化物に焦点を当てる。
オルガノイドは、従来の細胞培養と臓器全体のギャップを埋める科学的イノベーションです。この分野の研究が進むにつれ、オルガノイドは幅広い用途でより効果的な治療法や治療法の開発に貢献する態勢を整えています。胃PDOの利用が増加していることを考えると、その生成に対する標準化されたアプローチがタイムリーに必要とされています。ここでは、上部内視鏡検査中に獲得した良性の胃生検組織から単離された単一細胞からヒト胃PDOを生成するためのプロトコルが記載されている。重要かつユニークなのは、標準化された数の単一細胞が播種のために決定され、胃PDOを確実に生成し、その後の特性評価を可能にすることです。この技術を使用すると、胃本体または胃前庭部のいずれかの生検から生成されたオルガノイドの形成と成長の信頼できる違いが実証されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
本明細書では、胃本体および前庭部からの良性上皮の生検から単離された単一細胞からヒト胃オルガノイドを確実に生成するための詳細なプロトコルが概説される。プロトコルの重要なステップは、タイミングと基底膜マトリックスの取り扱いを中心に展開します。生存率を維持するためには、生検組織を取得した後、できるだけ早くプロトコルを開始することが不可欠です。目的は、生検?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ペンシルベニア大学ゲノム医学T32 HG009495(KHB)、NCI R21 CA267949(BWK)、Basser Center for BRCAの男性とBRCAプログラム(KHB、BWK)、デグレゴリオファミリー財団助成賞(BWK)。
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| A83-01 | R&D Systems | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| BZ-X710 | Keyence | n/a | |
| cellSens | Olympus | n/a | |
| Collagenase III | Worthington | LS004182 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
| Dithiothreitol (DTT) | EMSCO/Fisher | BP1725 | |
| DPBS | Gibco | 14200-075 | |
| Fungin | InvivoGen | NC9326704 | |
| Gastrin I | Sigma Aldrich | G9145 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 1570060 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| hFGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| Matrigel | Corning | 47743-715 | |
| Metronidazole | MP Biomedicals | 155710 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| Noggin ELISA Kit | Novus Biologicals | NBP2-80296 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| R-Spondin ELISA Kit | R&D Systems | DY4120-05 | |
| Wnt-3a ELISA Kit | R&D Systems | DY1324B-05 | |
| Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 |
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