Gastrisk pasientavledede organoider finner økende bruk i forskning, men formelle protokoller for generering av humane gastriske organoider fra enkeltcellefordøyelser med standardisert såtetthet mangler. Denne protokollen presenterer en detaljert metode for pålitelig å lage mageorganoider fra biopsivev oppnådd under øvre endoskopi.
Gastrisk pasientavledede organoider (PUD) tilbyr et unikt verktøy for å studere gastrisk biologi og patologi. Disse PUD-ene blir derfor stadig mer brukt i en lang rekke forskningsapplikasjoner. Imidlertid eksisterer det mangel på publiserte tilnærminger for å produsere gastriske PUDer fra enkeltcellefordøyelser samtidig som man opprettholder en standardisert innledende cellesåingstetthet. I denne protokollen legges det vekt på initiering av mageorganoider fra isolerte enkeltceller og tilveiebringelse av en metode for passering av organoider gjennom fragmentering. Det er viktig at protokollen viser at en standardisert tilnærming til den opprinnelige cellesåingstettheten konsekvent gir gastriske organoider fra godartet biopsivev og muliggjør standardisert kvantifisering av organoidvekst. Endelig støtter bevis den nye observasjonen at gastriske PUDer viser varierende dannelses- og veksthastigheter basert på om organoider stammer fra biopsier i kroppen eller antralområdene i magen. Spesielt er det avslørt at bruken av antralbiopsivev for organoid initiering resulterer i et større antall organoider dannet og raskere organoidvekst over en 20-dagers periode sammenlignet med organoider generert fra biopsier i magelegemet. Protokollen beskrevet her gir etterforskere en rettidig og reproduserbar metode for vellykket generering og arbeid med gastrisk PUD.
Organoider er miniatyr tredimensjonale (3D) cellulære strukturer som ligner arkitekturen og funksjonaliteten til organene de ble avledet fra 1,2. Disse lab-dyrkede modellene er opprettet ved å dyrke stamceller eller vevsspesifikke celler i et kontrollert miljø som gjør at disse cellene kan organisere seg selv og differensiere i forskjellige celletyper 1,2,3. En av de viktigste fordelene med organoider er deres evne til å rekapitulere menneskelig biologi nærmere enn tradisjonelle todimensjonale (2D) cellekulturer 1,2,3. Spesielt har menneskelige organoider vist seg å opprettholde det genetiske mangfoldet av deres opprinnelsesvev 3,4,5. Organoider tilbyr en unik mulighet til å studere menneskelig organutvikling, modellsykdommer og teste potensielle terapier i en kontrollert laboratorieinnstilling. Videre kan organoider utledes fra individuelle pasientprøver, noe som muliggjør personlig medisintilnærming og potensiell utvikling av individualiserte behandlinger 3,6,7.
Forskere har brukt humane gastriske organoider til å undersøke ulike aspekter av gastrisk biologi og patologi. Fremtredende eksempler inkluderer bruk av pasientavledede organoider (PUD) for å forutsi cellegiftrespons i magekreft 8,9,10 og modellere epitelresponsen på Helicobacter pylori-infeksjon 11,12,13. Humane gastriske organoider består av forskjellige celletyper som finnes i magen, inkludert nakkeceller, pitceller og andre støttende celler11,14. Gastrisk organoider kan enten genereres fra induserte pluripotente stamceller (iPSCs) eller stamceller direkte isolert fra magevev oppnådd via biopsier eller fra gastriske reseksjonsprøver11,14. Isoleringen av magestamceller fra magevev gjøres vanligvis ved å isolere og dyrke magekjertler eller enzymatisk fordøye vevsprøver for å frigjøre enkeltceller 9,13,15. Det er viktig at differensieringen av celler i gastrisk organoider generert ved hjelp av en av disse teknikkene har vist seg å være lik13. Protokollen beskrevet her fokuserer på en enkeltcellefordøye.
Organoider representerer en vitenskapelig innovasjon som bygger bro mellom tradisjonell cellekultur og hele organer. Etter hvert som forskningen på feltet fortsetter å utvikle seg, er organoider klare til å bidra til utvikling av mer effektive behandlinger og terapier for et bredt spekter av applikasjoner. Gitt den økende bruken av gastrisk PUD, er det et rettidig behov for en standardisert tilnærming til deres generasjon. Her beskrives protokollen for generering av humane gastriske PUDer fra enkeltceller isolert fra godartet gastrisk biopsivev oppnådd under øvre endoskopi. Viktig og unikt er et standardisert antall enkeltceller bestemt for såing for pålitelig å generere gastriske PUDer og tillate etterfølgende karakterisering. Ved hjelp av denne teknikken demonstreres pålitelige forskjeller i dannelsen og veksten av organoider generert fra biopsier av enten magelegemet eller magesekken.
Her er en detaljert protokoll for pålitelig generering av humane gastriske organoider fra enkeltceller isolert fra biopsier av godartet epitel fra magelegemet og antrum skissert. Kritiske trinn i protokollen dreier seg om timing samt håndtering av kjellermembranmatrisen. For å bevare levedyktigheten er det viktig å starte protokollen så snart som mulig etter å ha anskaffet biopsivevet. Målet er å begynne å fordøye biopsivevet innen 30 minutter etter at biopsien er utført. Håndtering av kjellermembranmatrisen …
The authors have nothing to disclose.
University of Pennsylvania Genomic Medicine T32 HG009495 (KHB), NCI R21 CA267949 (BWK), Men &; BRCA-programmet ved Basser Center for BRCA (KHB, BWK), DeGregorio Family Foundation Grant Award (BWK).
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
A83-01 | R&D Systems | 2939 | |
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
B27 | Invitrogen | 17504044 | |
BZ-X710 | Keyence | n/a | |
cellSens | Olympus | n/a | |
Collagenase III | Worthington | LS004182 | |
Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
Dithiothreitol (DTT) | EMSCO/Fisher | BP1725 | |
DPBS | Gibco | 14200-075 | |
Fungin | InvivoGen | NC9326704 | |
Gastrin I | Sigma Aldrich | G9145 | |
Gentamicin | Invitrogen | 1570060 | |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
hFGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
Matrigel | Corning | 47743-715 | |
Metronidazole | MP Biomedicals | 155710 | |
N2 Supplement | Invitrogen | 17502048 | |
Noggin ELISA Kit | Novus Biologicals | NBP2-80296 | |
Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11875-085 | |
R-Spondin ELISA Kit | R&D Systems | DY4120-05 | |
Wnt-3a ELISA Kit | R&D Systems | DY1324B-05 | |
Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 |