Qui, presentiamo un metodo semplice per l'osservazione diretta e la misurazione automatizzata delle risposte stomatiche all'invasione batterica in Arabidopsis thaliana. Questo metodo sfrutta un dispositivo di imaging stomatico portatile, insieme a una pipeline di analisi delle immagini progettata per le immagini delle foglie catturate dal dispositivo.
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Articolo metodologico
Osservazione diretta e misurazione automatizzata delle risposte stomatiche a Pseudomonas syringae pv. pomodoro DC3000 in Arabidopsis thaliana
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli stomi sono pori microscopici che si trovano nell'epidermide fogliare della pianta. La regolazione dell'apertura stomatica è fondamentale non solo per bilanciare l'assorbimento di anidride carbonica per la fotosintesi e la perdita d'acqua traspirante, ma anche per limitare l'invasione batterica. Mentre le piante chiudono gli stomi al riconoscimento di microbi, i batteri patogeni, come Pseudomonas syringae pv. pomodoro DC3000 (Pto), riaprire gli stomi chiusi per accedere all'interno della foglia. Nei saggi convenzionali per la valutazione delle risposte stomatiche all'invasione batterica, i peeling epidermici delle foglie, i dischi fogliari o le foglie staccate vengono fatti galleggiare su una sospensione batterica, quindi gli stomi vengono osservati al microscopio seguiti dalla misurazione manuale dell'apertura stomatica. Tuttavia, questi saggi sono ingombranti e potrebbero non riflettere le risposte stomatiche all'invasione batterica naturale in una foglia attaccata alla pianta. Recentemente, è stato sviluppato un dispositivo di imaging portatile in grado di osservare gli stomi pizzicando una foglia senza staccarla dalla pianta, insieme a una pipeline di analisi delle immagini basata sul deep learning progettata per misurare automaticamente l'apertura stomatica dalle immagini delle foglie catturate dal dispositivo. Qui, sulla base di questi progressi tecnici, viene introdotto un nuovo metodo per valutare le risposte stomatiche all'invasione batterica in Arabidopsis thaliana . Questo metodo consiste in tre semplici fasi: inoculazione a spruzzo di Pto che imita i processi di infezione naturali, osservazione diretta degli stomi su una foglia della pianta inoculata con presa di forza utilizzando il dispositivo di imaging portatile e misurazione automatizzata dell'apertura stomatica tramite la pipeline di analisi delle immagini. Questo metodo è stato utilizzato con successo per dimostrare la chiusura e la riapertura stomatica durante l'invasione della presa di forza in condizioni che imitano da vicino l'interazione naturale pianta-batterio.
Introduzione
Gli stomi sono pori microscopici circondati da un paio di cellule di guardia sulla superficie delle foglie e di altre parti aeree delle piante. In ambienti in continua evoluzione, la regolazione dell'apertura stomatica è fondamentale per le piante per controllare l'assorbimento di anidride carbonica necessario per la fotosintesi a scapito della perdita d'acqua attraverso la traspirazione. Pertanto, la quantificazione dell'apertura stomatica è stata fondamentale per comprendere l'adattamento ambientale delle piante. Tuttavia, la quantificazione dell'apertura stomatica è intrinsecamente dispendiosa in termini di tempo e ingombrante in quanto richiede il lavoro umano per....
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Protocollo
1. Piante in crescita
- Per interrompere la dormienza, risospendere i semi di A. thaliana (Col-0) in acqua deionizzata e incubarli a 4 °C per 4 giorni al buio.
- Semina i semi sul terreno e coltiva in una camera dotata di luce fluorescente bianca. Mantenere le seguenti condizioni di crescita: temperatura di 22 °C, intensità luminosa di 6.000 lux (ca. 100 μmol/m2/s) per 10 ore e umidità relativa del 60%.
- Quando necessario, annaffia le piante con un fertilizzante liquido. Astenersi dall'annaffiare da 1 settimana a 2 giorni prima dell'inoculazione e innaffiare bene 1 giorno prima dell'inoculazione.
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Risultati
Dopo l'inoculazione spray di Pto, gli stomi sulle foglie attaccate alle piante inoculate sono stati osservati direttamente dal dispositivo di imaging stomatico portatile. Utilizzando misurazioni manuali e automatizzate, le stesse immagini delle foglie sono state utilizzate per calcolare l'apertura stomatica prendendo rapporti tra larghezza e lunghezza di circa 60 stomi. Le misurazioni manuali e automatizzate hanno indicato costantemente una diminuzione dell'apertura stomatica nelle piante inoculate con presa.......
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Discussione
Studi precedenti hanno utilizzato peeling epidermici, dischi fogliari o foglie staccate per studiare le risposte stomatiche alle invasioni batteriche 9,11,12. Al contrario, il metodo proposto in questo studio sfrutta il dispositivo portatile di imaging stomatico per osservare direttamente gli stomi su una foglia attaccata alla pianta dopo l'inoculazione spray di Pto, imitando le condizioni naturali di invasione batteric.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Ringraziamenti
Ringraziamo tutti i membri del progetto di ricerca, "Co-creazione di tratti adattativi vegetali tramite assemblaggio di olobionte pianta-microbo", per le fruttuose discussioni. Questo lavoro è stato sostenuto da Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (21H05151 e 21H05149 ad A.M. e 21H05152 a Y.T.) e Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research (22K19178 ad A. M.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Agar | Nakarai tesque | 01028-85 | |
| ANEST IWATA | MX2900 | Kit di accessori per SPRINT JET | |
| Biotron | Nippon Medical & Chemical Instruments | LPH-411S | Camera di crescita delle piante con luce fluorescente bianca |
| Glycerol | Wako | 072-00626 | |
| Mezzo vassoio | Sakata | 72000113 | Un set di vassoio e coperchio |
| Hyponex | Hyponex | Nessun numero di catalogo disponibile | Diluire la soluzione di Hyponex in un rapporto di 1:2000 in acqua deionizzata per innaffiare le piante |
| Immagine J | Istituto Nazionale di Utilizzato | per la misurazione manuale dell https://imagej.nih.gov/ij/download.html'apertura stomatica | |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| KCl | Wako | 163-03545 | |
| KOH | Wako | 168-21815 | Per MES-KOH |
| MES | Wako | 343-01621 | Per MES-KOH |
| Dispositivo portatile per imaging stomatico | Phytometrics | Order at https://www.phytometrics.jp/ | Takagi et al.(2023) doi: 10.1093/pcp/pcad018. |
| Rifampicina | Wako | 185-01003 | Sciogliere in DMSO |
| Silwet-L77 | Scienze biomediche | BMS-SL7755 | tensioattivo siliconico utilizzato nell'inoculazione spray |
| SPRINT JET | ANEST IWATA | IS-800 | Aerografo utilizzato per l'inoculazione spray |
| SuperMix A | Sakata | seed 72000083 | Mescolare con Vermiculite G20 in proporzioni uguali per la preparazione del terreno |
| Tryptone | Nakarai tesque | 35640-95 | |
| Vermiculite G20 | Nittai | Nessun numero di catalogo disponibile | Miscelare con Super Mix A in proporzioni uguali per la preparazione del terreno |
| Luce fluorescente bianca | NEC | FHF32EX-N-HX-S | Utilizzato per Biotron |
Riferimenti
- Shimono, M., Higaki, T., Kaku, H., Shibuya, N., Hasezawa, S., Day, B. Quantitative evaluation of stomatal cytoskeletal patterns during the activation of immune signaling in Arabidopsis thaliana. PLoS One. 11, e0159291(2016).
- Bourdais, G., et al.
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Ristampe e permessi
