En skyddsanalys utvecklades för att övervaka näthinnans kärlens motståndskraft mot dödsfall från diabetes/diabetisk retinopati-relaterade förolämpningar som oxidativ stress och cytokiner.
Diabetisk retinopati (DR) är en komplex och progressiv ögonsjukdom som kännetecknas av två distinkta faser i patogenesen. Den första fasen innebär förlust av skydd mot diabetesinducerad skada på näthinnan, medan den andra fasen fokuserar på ackumulering av denna skada. Traditionella analyser fokuserar främst på att utvärdera kapillärdegeneration, vilket är en indikation på skadans allvarlighetsgrad, och tar i huvudsak itu med den andra fasen av DR. De ger dock bara indirekt insikter om huruvida skyddsmekanismerna i näthinnans kärl har äventyrats. För att ta itu med denna begränsning utvecklades ett nytt tillvägagångssätt för att direkt bedöma näthinnans skyddsmekanismer – särskilt dess motståndskraft mot diabetesinducerade förolämpningar som oxidativ stress och cytokiner. Denna skyddsanalys, även om den ursprungligen utformades för diabetisk retinopati, har potential för bredare tillämpningar i både fysiologiska och patologiska sammanhang. Sammanfattningsvis, för att förstå patogenesen av diabetisk retinopati innebär det att känna igen de dubbla faserna av skyddsförlust och skadeackumulering, med denna innovativa skyddsanalys som erbjuder ett värdefullt verktyg för forskning och potentiellt sträcker sig till andra medicinska tillstånd.
Diabetesretinopati (DR) är en av de mikrovaskulära komplikationerna av diabetes mellitus (DM) och den främsta orsaken till blindhet hos personer i arbetsför ålder i utvecklade länder1. Viktiga riskfaktorer för diabetesretinopati är varaktigheten och graden av hyperglykemi 2,3,4. Medan DM orsakar dysfunktion i både de vaskulära och neurala komponenterna i näthinnan5, är diagnosen DR baserad på morfologiska egenskaper hos näthinnans kärl6.
Hyperglykemi-inducerad oxidativ stress är en av drivkrafterna för DR-patogenes7. Ökad oxidativ stress orsakar omfattande skador, vilket äventyrar mitokondriernas funktionalitet och därmed ytterligare ökar nivån av reaktiva syrearter. Dessa händelser åtföljs av läckage av näthinnekärl, en ökning av nivån av inflammatoriska cytokiner och död av både neurala och vaskulära celltyper i näthinnan. Förlust av kärlceller, och därmed funktionaliteten hos näthinnans omfattande kapillärnätverk, resulterar i hypoxi, en potent stimulans för en mängdolika svar. Sådana svar inkluderar ökat uttryck av vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF) som driver både permeabilitet och angiogenes, kardinaldrag i de avancerade, synhotande stadierna av DR – diabetiskt makulaödem och proliferativ diabetisk retinopati6.
Vissa egenskaper hos DR tyder på att en organism (både patienter och försöksdjur) har en inneboende förmåga att motstå denna indikation. Patienter upplever flera decennier av DM innan de utvecklar synhotande DR 8,9,10,11,12,13. Även om gnagarmodeller av DM inte utvecklar de avancerade, synhotande stadierna av DR14, gör den initiala/milda formen av DR som manifesterar sig det först efter en period av veckor eller månader med DM15,16. Dessutom, hos både patienter och försöksdjur, är DR progressiv, och retinal dysfunktion/skada ökar när varaktigheten av DM förlängs. Slutligen utvecklar vissa patienter med DM aldrig DR. I vissa fall beror detta på att sådana individer inte upplever diabetes tillräckligt länge för att DR ska utvecklas. I andra fall beror det på att de uppvisar extraordinär motståndskraft mot DR; vilket är fallet med deltagarna i Medalist-studien, som inte utvecklar DR efter 50 eller fler år med DM17. Trots ett sådant övertygande stöd för existensen av skydd mot DR och dess enorma translationella relevans, har mekanismen bakom skyddet inte undersökts aggressivt.
Skyddsanalysen som beskrivs här utvecklades för att underlätta undersökning av varför DR fördröjs från början av DM hos diabetiska möss. De viktigaste stegen i denna analys, som tillämpas på DM- och icke-DM-möss, inkluderar (1) att leverera en submaximal dödsframkallande förolämpning mot ögat (ex vivo eller in vivo), (2) att isolera näthinnans kärl, (3) att färga kärlen med TUNEL och DAPI, (4) att fotografera de resulterande bilderna och kvantifiera procentandelen TUNEL/DAPI dubbelpositiva arter.
I denna studie etablerades en analys för att detektera resistens/sårbarhet hos näthinnans kärl för död inducerad av DM/DR-relaterade förolämpningar såsom ischemi/oxidativ stress och cytokiner. Detta manuskript ger en detaljerad beskrivning av denna analys, som är en modifiering av flera publicerade protokoll 19,20,21.
Protokollet omfattar flera avgörande steg. För det första är det absolut nödvändigt att noggrant dissekera näthinnan, vilket säkerställer att det vaskulära nätverket bevaras och förhindrar betydande revor. Detta kan åstadkommas genom att göra ett snitt 2-3 mm bakom limbus eftersom näthinnan fäster tätt vid ora serrata, och att separera den är utmanande. För det andra, belägg alla instrument som kommer i kontakt med kärlen (t.ex. enhårsborstar, överföringspipett och pincett) med trypsin genom att doppa dessa verktyg i YL-trypsinlösningen under hela proceduren. Detta förhindrar att kärlen fäster vid de instrument som används i detta protokoll. För det tredje, eftersom mikrokärlen är nästan osynliga under normalt ljus, krävs ökad vaksamhet under aspiration av skräp och överföring till objektglaset för att förhindra oavsiktlig förlust.
En lämplig grad av enzymatisk nedbrytning av de olika lagren i näthinnan är avgörande; Otillräcklig matsmältning förhindrar separation av neuronal vävnad från kärlnätverket, medan överdriven matsmältning löser upp vaskulär plexus. Olika matsmältningstider från 1 timme19 till 23 timmar över natten har rapporterats. Baserat på observationer ger en matsmältningstid på 4 timmar och 15 minuter de mest gynnsamma resultaten jämfört med varaktigheter på 2 timmar, 3 timmar och 4 timmar. Att förlänga matsmältningen bortom denna punkt kommer sannolikt inte att förbättra processen och kan istället äventyra kärlens integritet.
I de fall där den smälta näthinnan fäster vid enhårsborsten, doppa håret i YL-trypsinlösning flera gånger. Detta minskar borstens klibbiga områden. Om hårborsten fortfarande fäster vid kärlvävnaden, inspektera den för kvarvarande fragment av glaskropp och ta bort dem med pincett.
Det optimala ögonblicket för fullständigt avlägsnande av glaskroppen är efter eliminering av fotoreceptorerna, men före avlägsnandet av den återstående nerv- och gliavävnaden. Näthinnan bibehåller styvheten tills fotoreceptorerna avlägsnas. Att extrahera glaskroppen i detta skede kan potentiellt slita sönder näthinnan/kärlen. De känsliga lagren av kvarvarande nerv- och gliavävnad spelar en avgörande roll för att bevara den krökta formen av kärlstrukturen. De förhindrar att näthinnan slits sönder i mitten när glaskroppen lossnar från synnerven.
Om den isolerade vaskulaturen inte fäster vid mikroskopglaset alls, indikerar det att den del av glaset där vidhäftning förväntas uppstå är smutsig. Försök att flytta kärlen över objektglasets yta för att hitta en klibbig plats, byt till en annan rutschkana eller rengör objektglaset noggrant och försök igen. Om kärlen fastnar på objektglaset innan de vecklar ut sig till sin skålliknande form, lyft kärlen från glaset så att det kan flyta fritt i vattnet igen. Gör detta steg med en pincett som upprepade gånger har doppats i YL-trypsinlösningen.
Flera alternativa tekniker för att isolera kärlen har rapporterats, vilka inte skulle vara lämpliga för den skyddsanalys som beskrivs här. Till exempel har osmotisk lys använts för att isolera kärlen från ofixerade näthinneprover, vilket underlättar biokemiska undersökningar av vävnaden24,25. Denna procedur kanske dock inte bevarar kärlens anatomi lika bra som det tillvägagångssätt som används i denna artikel. På samma sätt, medan vävnadsavtrycksmetoden för att isolera stora segment av mikrovaskulatur möjliggör analys av kärlens elektrotoniska arkitektur26, återfinns vanligtvis inte hela kärlbädden.
Denna analys utvecklades eftersom befintliga metoder för att övervaka kapillärdegeneration inte tar itu med frågan om skydd. Kapillärdegeneration, som uppstår efter långvarig DM, indikerar om DR har utvecklats. Förutom att diagnostisera DR är detta resultat användbart för att bedöma om ett medel/terapi förhindrar DR. Befintliga kapillärdegenerationsanalyser talar dock inte om den underliggande verkningsmekanismen för medlet. Ett sådant medel kan förhindra patologiska händelser som driver DR, såsom ökad oxidativ stress eller cytokiner. Alternativt kan medlet förstärka skyddet genom att öka motståndskraften mot oxidativ stress och cytokiner och/eller främja reparation av skador. Denna nya skyddsanalys kan användas för att avgöra om den gynnsamma effekten av en viss terapi innebär att man förstärker det endogena systemet som skyddar mot DM-relaterad död.
En nackdel med denna skyddsanalys är att den inte skiljer mellan de två celltyperna i näthinnans kärl: endotelceller (EC) och pericyter (PC). Även om utseendet på deras kärnor i PASH-färgade sektioner är celltypsspecifikt (figur 6), uppvisar inte alla kärnor diagnostiska egenskaper. Cirka 30 % av kärnorna kan inte entydigt definieras som EC eller PC, åtminstone delvis på grund av att de tvådimensionella bilderna som erhålls från PASH-färgade prover ofullständigt upplöser den tredimensionella strukturen hos vaskulär plexus. Detta hinder skulle kunna övervinnas genom ytterligare analyser, t.ex. immunofluorescensfärgning med celltypsspecifika markörer. Sådana bilder, som skiljer de två celltyperna åt, kan färgas tillsammans med TUNEL för att bestämma resistensen/sårbarheten hos var och en av de vaskulära celltyperna.
Denna vaskulärfokuserade analys ger ingen information om den neurala näthinnan. Ytterligare analyser skulle kunna utvecklas för att tillhandahålla sådan information. Till exempel, istället för att isolera näthinnans kärl, kan en encellssuspension av hela näthinnan genereras och sedan analyseras (genom fluorescerande aktiverad cellsortering) för resistens/sårbarhet. Inkludering av celltypsspecifika markörer (både neurala och vaskulära) tillsammans med indikatorer på celldöd skulle ge en mer komplett bild av de näthinnecelltyper som har kapacitet att skydda mot DM/DR-medierad död.
Sammanfattningsvis ger skyddsanalysen som beskrivs här ett kraftfullt tillvägagångssätt för att undersöka mekanismen som är ansvarig för fördröjningen mellan uppkomsten av DM och manifestationen av DR hos möss.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av anslag från Illinois Society to Prevent Blindness, National Institute of Health (EY031350 och EY001792) och ett obegränsat bidrag från Research to Prevent Blindness Foundation.
10% neutral buffered formalin | Fischer Scientific | SF100-4 | Fixation |
24-well plates | Falcon | 353047 | |
33 G needle | Hamilton | customized | |
Ammonium hydroxide | Sigma | 221228-1L-PCA | |
C57/BL6/J mice | The Jackson Laboratory | Jax #000664 | |
Cytokine cocktail | consisted of a 1:1:1 ratio of 1 µg/mL TNF-α, 1 µg/mL IL-1 β and and 1500 U/µLIFN- γ | ||
Dissecting microscope | Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. | ||
Dumont #3 forceps | Fine Science Tools (FST) | 11231-30 | Straight tips |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools (FST) | 11253-25 | Micro-blunted tips |
Easy-Grip Tissue Culture Dishes | Falcon | 353001 | 35 x 10 mm |
Glass transfer pipet | Fischer Scientific | 1367820A | snap off the thin end of a Pasteur pipet and fit the “broken” end with a rubber bulb. |
Harris modified hematoxylin | Sigma | HHS32 | |
Image J | NIH, Bethesda | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein | Milipore | 11684795910 | TUNEL reaction mixture |
Micro cover glasses | VWR | 48366-227 | 22 mm x 22 mm |
Microknife | Sharpoint | 72-1551 | |
Micro-spatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
Mounting cassette | Any transparent cassette that is slightly bigger than the microscope slide | ||
Periodic acid | Sigma | 3951 | |
Periodic acid solution | 35 mM periodic acid with 12 mM sodium acetate in H2O | ||
Permount mounting medium | Fischer Scientific | SP15- 100 | |
Prism 9 | GraphPad | ||
Prolog Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
Recombinant human IFN- γ | Peprotec | 300-02 | |
Recombinant human IL-1 β | Peprotec | 200-01B | |
Recombinant human TNF-α | Peprotec | 300-01A | |
Schiff reagent base | Sigma | 3952016 | |
Shaker Incubator (belly button shaker) | IBI Scientific | BBUAAUV1S | |
Sodium acetate | Sigma | 71196 | |
Steritop sterile vacuum bottle | Millipore | SCGPS05RE | Create filtered water |
Superfrost Plus treated microscope slides | Fischer Scientific | 12-550-15 | use slides from unopened box |
Tert-butyl hydroperoxide (TBH) | Sigma | 75-91-2 | |
TRIZMA base | Fischer Scientific | 11-101-5522 | make 100 mM Tris, adjust pH to 7.8 using HCl) |
Trypsin 1:250 | Amresco | 0458-50G | |
Two “brushes” | made from single black hair taped to the end of plastic transfer pipet. One brush with a free end. The other brush with a loop | ||
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools (FST) | 15000-00 | |
Xylene | Sigma | 65351-M | |
YL trypsin solution | 3% trypsin in 0.1 M Tris (pH 7.8) | ||
Zeiss LSM 710 fluorescence microscope | Zeiss Microscopy |