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Articolo metodologico

Riutilizzo della provetta per ultracentrifuga in policarbonato nelle analisi proteomiche delle vescicole extracellulari

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DOI:

10.3791/66126

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8 marzo 2024

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1Center for Interdisciplinary Cardiovascular Sciences, Cardiovascular Division, Department of Medicine, Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School, 2Mechanobiology and Medical Device Research Group (MMDRG), Biomedical Engineering, College of Science and Engineering, University of Galway, 3Department of CDL Research, University Medical Center Utrecht, 4Department of Biomolecular Health Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Utrecht University, 5Center for Excellence in Vascular Biology, Cardiovascular Division, Department of Medicine, Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Viene fornito un protocollo dettagliato per la pulizia e il riutilizzo delle provette per ultracentrifuga in policarbonato per eseguire l'isolamento delle vescicole extracellulari adatto per esperimenti di proteomica.

Abstract

Le plastiche monouso da laboratorio aggravano la crisi dell'inquinamento e contribuiscono ai costi dei materiali di consumo. Nell'isolamento delle vescicole extracellulari (EV), le provette per ultracentrifuga in policarbonato (UC) vengono utilizzate per sopportare le elevate forze centrifughe associate. La proteomica EV è un campo in progresso e mancano protocolli di riutilizzo convalidati per questi tubi. Il riutilizzo dei materiali di consumo per i protocolli di isolamento delle proteine a basso rendimento e la proteomica a valle richiede la compatibilità dei reagenti con le acquisizioni di spettroscopia di massa, come l'assenza di contaminazione da polimeri sintetici derivati da provette da centrifuga e una sufficiente rimozione delle proteine residue.

Questo protocollo descrive e convalida un metodo per la pulizia dei tubi UC in policarbonato per il riutilizzo in esperimenti di proteomica EV. Il processo di pulizia prevede l'immersione immediata dei tubi UC in H2O per prevenire l'essiccazione delle proteine, il lavaggio in detergente dodecilsolfato di sodio (SDS) allo 0,1%, il risciacquo in acqua calda del rubinetto, acqua demineralizzata ed etanolo al 70%. Per convalidare il protocollo di riutilizzo delle provette UC per la proteomica delle vescicole extracellulari a valle, sono state ottenute provette usate a seguito di un esperimento che isolava le vescicole extracellulari dal tessuto cardiovascolare utilizzando la colite ulcerosa differenziale e la separazione del gradiente di densità. Le provette sono state pulite e il processo sperimentale è stato ripetuto senza campioni EV confrontando provette UC vuote mai utilizzate con provette UC pulite. I pellet pseudo-EV ottenuti dalle procedure di isolamento sono stati lisati e preparati per cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem utilizzando un kit di preparazione del campione proteico commerciale con modifiche per campioni proteici a bassa abbondanza.

Dopo la pulizia, il numero di proteine identificate è stato ridotto del 98% nello pseudo-pellet rispetto al precedente campione di isolamento EV dalla stessa provetta. Confrontando una provetta pulita con una provetta vuota, entrambi i campioni contenevano un numero molto piccolo di proteine (≤20) con una somiglianza dell'86%. È stata confermata l'assenza di picchi polimerici nei cromatogrammi delle provette pulite. In definitiva, la validazione di un protocollo di pulizia dei tubi UC adatto all'arricchimento dei veicoli elettrici ridurrà i rifiuti prodotti dai laboratori di veicoli elettrici e abbasserà i costi sperimentali.

Introduzione

Le vescicole extracellulari (EV) sono particelle delimitate da doppio strato lipidico rilasciate da cellule che trasportano carichi biologicamente attivi, come le proteine, e partecipano a vari processi biologici, tra cui la comunicazione cellula-cellula e la formazione di mineralizzazione biologica1. Queste particelle si trovano in tutti i fluidi e tessuti corporei e le loro attività biologiche e usi sono un campo di ricerca scientifica in rapida evoluzione. L'isolamento e la convalida di queste nanoparticelle presentano varie sfide a causa delle loro piccole dimensioni e della biosimilarità con altre particelle, come liposomi e aggregati proteici. Le più recenti linee guida della Società Internazionale delle Vescicole Extracellulari, Informazioni minime per gli studi sulle vescicole extracellulari 2018 (MISEV2018), sono lo standard riconosciuto per la ricerca scientifica sulle vescicole extracellulari2.

Per l'isolamento delle vescicole extracellulari devono essere utilizzati vari metodi, spesso in tandem, a seconda della sorgente a monte e delle applicazioni a valle. A partire dal 2015, il metodo di isolamento primario più comune per le vescicole extracellulari era l'ultracentrifugazione differenziale (UC)2. In linea di principio, la centrifugazione iniziale a bassa velocità separa i componenti indesiderati più grandi o più densi, come cellule e detriti cellulari, lasciando le vescicole extracellulari nel surnatante. Successivamente, l'UC utilizza una forza centrifuga molto elevata per estrarre e quindi separare e purificare le vescicole extracellulari da altre particelle più piccole o meno dense, ma che possono contenere anche particelle dense non EV. La maggior parte dei protocolli utilizzerà spesso, in un passaggio o nell'altro, l'UC per isolare le vescicole extracellulari da un fluido3. Inoltre, l'UC viene utilizzato in altri metodi di isolamento delle vescicole extracellulari, come l'ultracentrifugazione a gradiente di densità (DGUC), che utilizza mezzi come lo iodixanolo OptiprepTM e la forza centrifuga per separare le vescicole extracellulari in base alla loro densità di galleggiamento4. Esistono altri metodi di isolamento delle vescicole extracellulari3.

Considerando la rapida evoluzione della comprensione dei processi biologici dettati dalle vescicole extracellulari e il loro potenziale come biomarcatori e informazioni riguardanti la fisiopatologia, le analisi basate sulla scoperta come la proteomica hanno guadagnato terreno 5,6,7,8. Le vescicole extracellulari sono piccole e, a seconda della fonte, hanno una bassa resa di proteine (<1 μg) rispetto al tessuto intero o al lisato cellulare. L'isolamento delle vescicole extracellulari per l'analisi proteomica richiede considerazioni speciali, come la rimozione di contaminanti proteici non EV da liquidi o tessuti a monte, la considerazione della degradazione delle proteine EV durante il processo di isolamento e l'utilizzo di metodi che creano soluzioni proteiche chimicamente compatibili con la preparazione di peptidi e le analisi di spettrometria di massa.

I materiali di consumo del laboratorio di ricerca sono spesso di plastica e di natura usa e getta. Questi materiali monouso contribuiscono alla crisi globale dell'inquinamento da plastica e ai costi dei materiali di consumo. I tubi UC specializzati in policarbonato e polistirene sono progettati per resistere alle elevate forze centrifughe richieste per pellettare i veicoli elettrici nelle applicazioni di laboratorio. Sebbene sia possibile sterilizzare e disinfettare le provette per colite ulcerosa per il riutilizzo, l'analisi proteomica, in particolare quelle a bassa resa proteica come le vescicole extracellulari, richiede un'attenzione speciale. Non solo è fondamentale una sufficiente rimozione delle proteine residue dall'uso precedente, ma deve essere considerata anche la compatibilità chimica con la spettroscopia di massa e la contaminazione da polimeri derivati dalla plastica.

Qui presentiamo un protocollo di pulizia dei tubi in policarbonato utilizzando detergenti adatti alla spettrometria di massa ed eseguiamo esperimenti per convalidare la sua rimozione di proteine residue al di sotto dei limiti di rilevamento e mancanza di contaminanti polimerici rilevabili. Per convalidare il protocollo di pulizia per applicazioni proteomiche EV utilizzando sia scopi UC che DGUC, abbiamo ottenuto provette da isolamenti di vescicole extracellulari di tessuto vascolare umano con un protocollo combinato UC e DGUC. Le provette sono state pulite utilizzando il protocollo descritto e il processo sperimentale è stato ripetuto senza campioni confrontando una provetta UC vuota mai utilizzata e una provetta UC pulita. In definitiva, la convalida di un protocollo di pulizia dei tubi UC adatto all'arricchimento dei veicoli elettrici ridurrà i rifiuti prodotti dai laboratori di veicoli elettrici e ridurrà i costi associati a tali esperimenti.

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Protocollo

1. Pulizia del tubo

NOTA: La procedura di isolamento EV utilizza tubi UC in policarbonato con e senza tappo (descritti di seguito). La stessa procedura è stata seguita sia per le provette tappate che per quelle non tappate. Nel caso dei tubi tappati, le parti del coperchio sono state pulite singolarmente e rimontate dopo l'asciugatura e il pre-stoccaggio.

  1. Dopo l'uso iniziale delle provette in policarbonato e la rimozione del campione, immergere immediatamente le provette UC in acqua di rubinetto per evitare che il campione si secchi sul lato della provetta.
  2. Trasferire e immergere le provette in dodecil solfato di sodio (SDS) allo 0,1% in acqua di rubinetto per 10 minuti.
  3. Una provetta alla volta, decantare la maggior parte, ma non tutta, della soluzione SDS dalla provetta e utilizzare un batuffolo di cotone per pulire accuratamente l'area della provetta in cui si trovava il pellet EV.
    NOTA: Non utilizzare nulla con setole. Questo protocollo utilizzava normali tamponi di cotone; tuttavia, per la pulizia dei tubi è possibile utilizzare tamponi di cotone specializzati e a basso contenuto di lanugine.
  4. Sciacquare almeno 3 volte con acqua calda del rubinetto (~50 °C). Assicurati di riempire e decantare completamente il tubo.
  5. Risciacquare 1 volta con acqua demineralizzata utilizzando un flacone spray o un flacone di lavaggio a bocca stretta.
  6. Risciacquare 1 volta con etanolo al 70% utilizzando un flacone spray.
  7. Lasciare asciugare il tubo capovolto.
    NOTA: I rack per provette per lo smistamento delle cellule attivate dalla fluorescenza funzionano bene per l'essiccazione delle provette UC.
  8. Metti i tubi completamente asciutti in un barattolo pulito; sono pronti per il riutilizzo.
    NOTA: Attualmente, il protocollo è convalidato per il riutilizzo fino a 2 volte.

2. Arricchimento EV

NOTA: Il seguente protocollo di isolamento delle vescicole extracellulari e proteomica è stato utilizzato sia per l'isolamento delle vescicole extracellulari tissutali originale, sia per i "campioni simulati" utilizzati per ottenere i campioni di provette bianche (mai utilizzate) e pulite. I campioni originali erano vescicole extracellulari intrappolate nel tessuto risospeso da placche carotidee di pazienti sottoposti a endoarterectomie carotidee. I campioni chirurgici sono stati raccolti dall'University Health Network (Toronto, Canada) e sono stati approvati dal comitato etico istituzionale. Tutti i pazienti hanno fornito il consenso informato per la raccolta dei campioni e l'analisi dei dati, in conformità con la Dichiarazione di Helsinki. I campioni simulati erano pseudo-pellet ottenuti dal trattamento di provette vuote e pulite con le stesse soluzioni e fasi di lavorazione dei campioni di isolamento EV.

  1. Scongela campioni EV o campioni simulati in PBS su ghiaccio.
  2. Preparare il tampone NTE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0,137 M NaCl pH 7,4) e il filtro sterile.
  3. Centrifugare i campioni a 10.000 × g per 10 minuti a 4 °C.
  4. Spostare il surnatante in una provetta in policarbonato aperta da 1 mL.
  5. Centrifugare il surnatante a 100.000× g per 1 ora a 4 °C.
  6. Risospendere il pellet in 150 μL di tampone NTE filtrato sterile con inibitore della proteasi.
  7. Trasferire in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e aggiungere il tampone NTE per raggiungere un volume totale del campione di 1,5 mL.
  8. Tenere i campioni sul ghiaccio.

3. Preparazione dei gradienti di densità e separazione dei gradienti di densità

NOTA: Questo protocollo di isolamento delle vescicole extracellulari è stato precedentemente descritto da Blaser et al.9 In breve:

  1. Preparare cinque soluzioni di terreno a gradiente di densità di iodixanolo (10%, 15%, 20%, 25% e 30%) con tampone NTE come diluente.
  2. Stratificare le cinque soluzioni di densità in sequenza in una o più provette per ultracentrifuga con tappo con il 30% in basso e il 10% in alto.
  3. Fissare i tappi sulle provette e spostarli delicatamente in posizione orizzontale stabile per 1 ora a temperatura ambiente.
  4. Dopo 1 ora, spostare delicatamente i tubi in posizione verticale sul ghiaccio per 30 minuti per raffreddare la pendenza.
  5. Aggiungere 1,5 mL del campione o del campione simulato (tampone NTE) alla parte superiore delle provette preparate con gradiente di densità.
  6. Provette da ultracentrifuga a 250.000 × g per 40 minuti a 4 °C.
  7. Rimuovere le frazioni superiori del gradiente di densità (2,4 mL) nelle provette per ultracentrifuga non tappate. Riempire fino a 9 mL con tampone NTE filtrato sterile.
  8. Pellettare le EV mediante ultracentrifugazione a 100.000 × g per 1 ora a 4 °C.
    NOTA: Cerchiare la posizione del pellet EV visibile o la posizione prevista con un pennarello. Ciò ti consentirà di pulire direttamente l'area del pellet con il tampone.
  9. Aspirare il surnatante spostando la provetta in posizione capovolta per 3 minuti. Rimuovere le goccioline rimanenti con un batuffolo di cotone prima di capovolgere la provetta con il lato destro rivolto verso l'alto.
  10. Risospendere il pellet EV in 12 μL di tampone di lisi nel kit di riferimento.

4. Preparazione di peptidi per la proteomica

NOTA: La preparazione del campione di proteomica è stata eseguita secondo il protocollo del kit con modifiche interne per campioni proteici a bassa abbondanza. Il protocollo modificato è il seguente:

  1. Lizzare, denaturare, ridurre e alchilare i campioni riscaldandoli in tampone di lisi a 95 °C per 10 minuti.
  2. Digerire i campioni utilizzando la soluzione di digestione di Lys-C/tripsina per 2 ore a 37 °C utilizzando 10 μL di soluzione di lisi dal campione e 10 μL di soluzione di digestato.
  3. Purifica i peptidi attraverso una cartuccia lavando via i contaminanti idrofili e idrofobici ed eluendo i peptidi purificati utilizzando soluzioni in kit.
  4. Essiccare i peptidi purificati in una velocità di vuoto a 45 °C per 45 minuti o fino a quando non sono asciutti.
    NOTA: Evitare l'essiccazione eccessiva dei peptidi.
  5. Conservare i campioni a -80 °C fino al momento del sequenziamento con spettrometria di massa.
  6. Aggiungere 17 μL di soluzione con carica LC ai peptidi essiccati.
  7. Lasciare i campioni in ghiaccio per 1 ora.
  8. Agitare brevemente i campioni e quindi sonicare in un bagno d'acqua a ultrasuoni per 5 minuti.
  9. Centrifugare i campioni con carico LC a 16.000 × g per 1 minuto, aspirare 15 μl dall'alto e separare in una nuova provetta.

5. Cromatografia liquida e sequenziamento con spettrometria di massa tandem

  1. Iniettare 2 μL di soluzione peptidica con carica LC su uno spettrometro di massa.
  2. Frazionare i peptidi utilizzando una configurazione a doppia colonna.
  3. Riscaldare la colonna a una temperatura costante di 45 °C.
  4. Eseguire il gradiente analitico a 300 nL/min dal 5% al 21% di solvente B (acetonitrile/0,1% di acido formico) per 60 minuti, seguito da 10 minuti di solvente B dal 21% al 30% e altri 10 minuti di un lavaggio con seghetto alternativo al 95%-5%.
  5. Impostare l'MS1 su una risoluzione di 120 K (tempo massimo di iniezione, 25 ms), sottoporre gli ioni precursori superiori (entro un tempo di ciclo di 3,0 s) a un'ampiezza di isolamento HCD di 1,2 m/z, esclusione dinamica abilitata (60 s) e impostare la risoluzione MS2 su 60 K (tempo massimo di iniezione, automatico; energia di collisione normalizzata, 24%, 26% e 28%).
  6. Impostare l'intervallo di acquisizione MS1 e MS2 rispettivamente su 400 m/z-1.200 m/z e 120 m/z-1.200 m/z.

6. Identificazione di peptidi/proteine

  1. Cercare gli spettri peptidici acquisiti con un software di ricerca proteomica utilizzando un algoritmo di ricerca commerciale su un database umano uniProt.
  2. Impostare l'enzima della digestione sulla tripsina e consentire fino a due scissioni mancate.
  3. Impostare la tolleranza del precursore su 10 ppm e la finestra di tolleranza del frammento su 0,02 Da.
  4. Impostare l'ossidazione della metionina e l'acetilazione N-terminale come modificazioni variabili e la carbamidometilazione della cisteina come modificazione fissa.
  5. Filtra i peptidi in base a una soglia del tasso di falsa scoperta (FDR) dell'1,0% calcolata dall'algoritmo Percolator.
  6. Considera unici solo i peptidi assegnati a un determinato gruppo proteico e non rilevati in nessun altro gruppo proteico e utilizzali per ulteriori analisi.
  7. Includere nelle analisi solo un minimo di due peptidi unici per ciascuna proteina.
  8. Massimizza gli ID con il rilevamento degli ioni precursori.
  9. Eseguire l'allineamento cromatografico con uno spostamento massimo del tempo di ritenzione di 10 minuti, una tolleranza di massa di 10 ppm e un rapporto segnale/rumore minimo di 5.
  10. Normalizza l'abbondanza di peptidi in base alla quantità totale di peptidi.

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Risultati

Per convalidare il protocollo di pulizia (Figura 1), sono stati eseguiti due esperimenti. In primo luogo, il proteoma del "campione simulato" dalla provetta pulita è stato confrontato con il proteoma del campione EV di tessuto dall'uso iniziale della provetta per determinare il carryover delle proteine identificate. I cromatogrammi rappresentativi mostrano una riduzione dell'eterogeneità dei picchi dopo la pulizia delle provette (Figura 2). Nell'isolamento origi...

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Discussione

Qui descriviamo e convalidiamo un protocollo per la pulizia dei tubi UC in policarbonato per l'arricchimento di veicoli elettrici e applicazioni proteomiche. Abbiamo dimostrato il successo della rimozione della proteina residua dal precedente campione di provetta UC rispetto a un'analisi pseudo-pellet pulita al di sotto del limite di rilevamento di questo protocollo di acquisizione con spettrometria di massa e abbiamo mostrato la somiglianza proteomica della provetta UC vuota mai utilizzata rispetto agli pseudo pellet de...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

Questo studio è stato supportato da una sovvenzione di ricerca del National Institutes of Health (NIH) R01HL147095, R01HL141917 e R01HL136431, Kowa Company, Ltd. e del programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione Europea nell'ambito dell'accordo di sovvenzione Marie Skłodowska-Curie n. 101023041 (R. Cahalane). La Figura 1 è stata creata con Biorender.com. L'attuale protocollo di pulizia è stato sviluppato modificando un protocollo di pulizia del tubo raccomandato presentato alla Giornata dell'educazione (https://www.youtube.com/watch?v=DOebcOes6iI) 2023 della Società internazionale delle vescicole extracellulari. Molte grazie alla dott.ssa Kathryn Howe e alla dott.ssa Sneha Raju dell'University Health Network (Università di Toronto, Canada) per i campioni originali di vescicole extracellulari del tessuto carotideo.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provetta in policarbonato a parete spessa aperta da 10 mlBeckman Coulter Life Sciences355630provetta per ultracentrifuga senza tappo 
Flacone in policarbonato da 10,4 ml con tappoBeckman Coulter Life Sciences355603provette per ultracentrifuga con tappo
un Acclaim PepMap 100 C18 Colonne HPLC, 75 &; m x 70 mm; e una colonna HPLC EASY-Spray, 75 &; m x 250 mmThermoFisher Scientific 164946e ES902Configurazione a doppia colonna
Tampone critico, testina di cotoneVWR89031-270Tampone di cotone
Exploris 480 frontale con sorgente EASY-Spray, accoppiato a una pompa HPLC Easy-nLC1200.ThermoFisher ScientificBRE725533Spettrometro di massa
Umano UniProt database (101043 voci, aggiornato a gennaio 2022)NANAIndice umano
MilliQ acqua
acqua PreOmics iST kit  Kit di preparazione del campione di proteine commercialePreOmicsP.O.00027
Scopritore di proteoma   pacchetto (PD, Versione 2.5)ThermoFisher ScientificNASoftware di ricerca proteomica
Algoritmo di ricerca SEQUEST-HT NANAAlgoritmo di ricerca
Sodio Dodecil Solfato (20%)Boston BioProductsBM-230detergente

Riferimenti

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