Questo protocollo descrive un approccio per l'esecuzione dell'imaging del calcio in organoidi intestinali umani infettati da virus e offre un approccio all'analisi.
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Articolo metodologico
Imaging del calcio vivo di monostrati di organoidi intestinali umani infettati da virus utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati
In questo articolo
Sommario
Abstract
La segnalazione del calcio è un regolatore integrale di quasi tutti i tessuti. All'interno dell'epitelio intestinale, il calcio è coinvolto nella regolazione dell'attività secretoria, nella dinamica dell'actina, nelle risposte infiammatorie, nella proliferazione delle cellule staminali e in molte altre funzioni cellulari non caratterizzate. Pertanto, la mappatura delle dinamiche di segnalazione del calcio all'interno dell'epitelio intestinale può fornire informazioni sui processi cellulari omeostatici e svelare risposte uniche a vari stimoli. Gli organoidi intestinali umani (HIO) sono un modello ad alto rendimento, derivato dall'uomo, per studiare l'epitelio intestinale e rappresentano quindi un sistema utile per studiare la dinamica del calcio. Questo documento descrive un protocollo per trasdurre stabilmente HIO con indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI), eseguire microscopia a fluorescenza dal vivo e analizzare i dati di imaging per caratterizzare in modo significativo i segnali di calcio. Come esempio rappresentativo, gli HIO tridimensionali sono stati trasdotti con lentivirus per esprimere stabilmente GCaMP6s, un GECI citosolico basato su proteine fluorescenti verdi. Gli HIO ingegnerizzati sono stati poi dispersi in una sospensione a cellula singola e seminati come monostrati. Dopo la differenziazione, i monostrati HIO sono stati infettati con rotavirus e/o trattati con farmaci noti per stimolare una risposta al calcio. Un microscopio a epifluorescenza dotato di una camera di imaging dal vivo umidificata a temperatura controllata ha consentito l'imaging a lungo termine di monostrati infetti o trattati con farmaci. Dopo l'imaging, le immagini acquisite sono state analizzate utilizzando il software di analisi ImageJ, disponibile gratuitamente. Nel complesso, questo lavoro stabilisce una pipeline adattabile per la caratterizzazione della segnalazione cellulare negli HIO.
Introduzione
Il calcio è un secondo messaggero ampiamente conservato che svolge un ruolo fondamentale nella regolazione della fisiologia cellulare1. Data la sua forte carica, le piccole dimensioni e l'elevata solubilità in condizioni fisiologiche, il calcio è un manipolatore ideale della conformazione proteica. Ciò rende il calcio un potente mezzo per trasdurre i segnali elettrochimici in alterazioni enzimatiche, trascrizionali o post-trascrizionali. I rigidi gradienti di concentrazione di calcio attraverso il reticolo endoplasmatico (ER) e le membrane plasmatiche creano un'elevata forza motrice che consente rapidi cambiamenti nella concentrazione citosolic....
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Protocollo
Tutti gli organoidi intestinali umani (HIO) utilizzati in questo protocollo e negli esperimenti rappresentativi sono stati derivati da tessuto umano ottenuto e mantenuto dal Texas Medical Center Digestive Diseases Enteroid Core. Tutti i campioni sono stati raccolti in conformità con un protocollo approvato dall'Institutional Review Board del Baylor College of Medicine.
1. Preparazione dei materiali e dei reagenti
- Per il mantenimento degli organoidi, raccogliere piastre a 24 pozzetti trattate con colture cellulari, matrice di membrana basale (BMM), provette coniche da 15 mL e provette coniche da 1,5 mL.
- Per ....
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Risultati
La Figura 1A mostra una cupola BMM contenente organoidi intestinali umani tridimensionali che sono stati trasdotti per esprimere stabilmente GCaMP6. La Figura 1B mostra la stessa linea di organoidi riplaccati come monostrato a 24, 48 e 72 ore dopo la semina. Per convalidare la funzione di GCaMP6s, il monostrato è stato sottoposto a imaging mediante microscopia a fluorescenza ogni 2 secondi per 4 minuti e 100 nM di ADP sono stati aggiunti al terreno dopo ~ 20 sec.......
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Discussione
Le alterazioni dei livelli citosolici di Ca2+ possono essere sia causa che effetto di patologie all'interno dell'epitelio 10,16,17. L'aumento del calcio citosolico può guidare direttamente la secrezione attraverso l'attivazione del canale del cloro calcio-dipendente TMEM16A18,19. L'attivazione di TMEM16A in risposta a Ca2+ consente l'efflusso apical.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti da divulgare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni R01DK115507 e R01AI158683 (PI: J. M. Hyser) del National Institutes of Health (NIH). Il supporto ai tirocinanti è stato fornito da NIH grants F30DK131828 (PI: J.T. Gebert), F31DK132942 (PI: F. J. Scribano) e F32DK130288 (PI: K.A. Engevik). Vorremmo ringraziare il Texas Medical Center Digestive Diseases Enteroid Core per aver fornito i terreni di mantenimento dell'organoide.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Advanced DMEM F12 | Gibco | 12634028 | |
| [Leu15]-Gastrin I | Sigma-Aldrich | G9145 | |
| 0,05% Tripsina EDTA | Gibco | ||
| 0,05% tripsina EDTA | Gibco | ||
| provette per microcentrifuga da 1,5 ml | Fisherbrand | 5408137 | |
| provette coniche da 15 ml | Thermofisher Scientific | 0553859A | |
| 16% formaldeide | Thermofisher Scientific | 28906 | |
| 1M | HEPES Gibco | 15630080 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CV | |
| Ago calibro 25 | Thermofisher Scientific | 1482113D | |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Advanced DMEM F12 | Gibco | 12634028 | |
| Antibiotico-antimicocitico | Gibco | 15240062 | |
| Antibiotico-antimicotico | Gibco | 15240062 | |
| B27 Integratore | Gibco | 17504-044 | |
| Albumina sierica bovina | FisherScientific | ||
| CellView Vetrino per colture cellulari, PS, 75/25 MM, fondo in vetro, 10 scomparti | Greiner | 543979 | |
| Collagen IV | Sigma Aldrich | C5533 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| Siero fetale bovino | Corning | 35010CV | |
| Siero fetale bovino | Corning | 35010CV | |
| Fluorobrite | Gibco | A1896701 | |
| GlutaMAX | Gibco | ||
| GlutaMAX | Gibco | ||
| Fattore di crescita epidermico umano | ProteinTech | HZ-1326 | |
| Vettore di lentivirusCostruttore | (variabile) | ||
| Matrigel | BD Biosceicen | 356231/CB40230C | |
| N2 Integratore | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetilcisteina | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Nunc Piastre a 24 pozzetti trattate con coltura cellulare | Thermofisher Scientific | 142475 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | TR1003G | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S70767 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151100 | |
| TrypLE Express Enzima, senza fenolo rosso | Thermofisher Scientific | 12604013 | |
| Tripsina | Worthington | Biochemical NC9811754 | |
| Y-27632 | Tocris | 1254 |
Riferimenti
- Bootman, M. D., Bultynck, G. Fundamentals of cellular calcium signaling: A primer. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (1), a038802(2020).
- Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
- Danese, A., et al.
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Ristampe e permessi
