הטבעת אור מתאם ומיקרוסקופ אלקטרונים
Summary
אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור מיקרוסקופ אור מתאם ומיקרוסקופ אלקטרונים לאחר הטבעה של Epon באמצעות חלבון פלואורסצנטי הנקרא mScarlet. שיטה זו יכולה לשמור על הפלואורסצנטיות ועל מבנה העל בו זמנית. טכניקה זו מקובלת על מגוון רחב של יישומים ביולוגיים.
Abstract
מיקרוסקופ אור ואלקטרונים מתאמי (CLEM) הוא מיקרוסקופ מקיף המשלב את מידע הלוקליזציה המסופק על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (FM) ואת ההקשר של אולטרה-מבנה תאי שנרכש על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים (EM). CLEM הוא פשרה בין פלואורסצנטיות לאולטרה-מבנה, ובדרך כלל, אולטרה-מבנה פוגע בפלואורסצנטיות. בהשוואה לשרפים הידרופיליים אחרים, כגון גליצידיל מתקרילט, HM20 או K4M, Epon מעולה בתכונות שימור וחיתוך אולטרה-מבנה. בעבר, הוכחנו כי mEosEM יכול לשרוד קיבוע אוסמיום טטרוקסיד והטבעה של אפון. באמצעות mEosEM השגנו לראשונה הטמעת גבי Epon CLEM, השומרת על הפלואורסצנטיות ועל מבנה העל בו זמנית. כאן, אנו מספקים פרטים שלב אחר שלב על הכנת דגימת EM, הדמיית FM, הדמיית EM ויישור התמונה. אנו גם משפרים את ההליכים לזיהוי אותו תא שצולם על ידי הדמיית FM במהלך הדמיית EM ומפרטים את הרישום בין תמונות FM ו- EM. אנו מאמינים שניתן להשיג בקלות הטמעת אור מתאם ומיקרוסקופ אלקטרונים לאחר Epon בעקבות פרוטוקול חדש זה במתקני EM מסורתיים.
Introduction
ניתן להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי (FM) כדי להשיג לוקליזציה והפצה של חלבון היעד. עם זאת, ההקשר המקיף את חלבון המטרה הולך לאיבוד, וזה חיוני לחקירה יסודית של חלבון המטרה. למיקרוסקופ אלקטרונים (EM) יש את רזולוציית ההדמיה הגבוהה ביותר, והוא מספק מספר פרטים תת-תאיים. עם זאת, EM חסר תיוג מטרה. על ידי מיזוג מדויק של התמונה הפלואורסצנטית שצולמה על ידי FM עם התמונה האפורה שנרכשה על ידי EM, אור מתאם ומיקרוסקופ אלקטרונים (CLEM) יכול לשלב את המידע המתקבל על ידי שני מצבי הדמיה אלה 1,2,3,4.
CLEM הוא פשרה בין פלואורסצנטיות לבין ultrastructure1. בגלל המגבלות של חלבונים פלואורסצנטיים הנוכחיים ונהלי הכנת דגימות EM מסורתיים, במיוחד השימוש בחומצה אוסמית (OsO4) ושרפים הידרופוביים כגון אפון, מבנה העל תמיד פוגע בפלואורסצנטיות5. OsO4 הוא מגיב חיוני בהכנת מדגם EM, המשמש לשיפור הניגודיות של תמונות EM. בהשוואה לשרפים מוטמעים אחרים, Epon מעולה בתכונות שימור וחיתוך אולטרה-מבנה5. עם זאת, אין חלבונים פלואורסצנטיים שיכולים לשמור על האות הפלואורסצנטי לאחר הטיפול ב-OsO4 ובהטבעה של Epon6. כדי להתגבר על מגבלות החלבונים הפלואורסצנטיים, פותחה הטמעה מוקדמת של LEM, שבה מתבצעת הדמיית FM לפני הכנת דגימת EM6. עם זאת, החיסרון של הטמעה מראש CLEM הוא הרישום הלא מדויק בין FM לבין תמונות EM5.
להיפך, שיטת CLEM לאחר הטבעה מבצעת את הדמיית FM לאחר הכנת דגימת EM, שדיוק הרישום שלה יכול להגיע ל 6-7 ננומטר 5,6. כדי לשמור על הפלואורסצנטיות של חלבונים פלואורסצנטיים, נעשה שימוש בריכוזים נמוכים מאוד של OsO4 (0.001%)3 או בשיטות ההכנה של EM בלחץ גבוה (HPF) והחלפת הקפאה (FS) 4,7 על חשבון מבנה העל שנפרץ או הניגודיות של תמונת ה- EM. הפיתוח של mEos4b מקדם מאוד את ההתקדמות של לאחר הטבעה CLEM, אם כי glycidyl methacrylate משמש שרף הטבעה5. עם הפיתוח של mEosEM, אשר יכול לשרוד את צביעת OsO4 והטבעה Epon, Epon פוסט הטבעה CLEM סופר רזולוציה הושגה בפעם הראשונה, שמירה על פלואורסצנטיות ו ultrastructure בו זמנית6. לאחר mEosEM, מספר חלבונים פלואורסצנטיים שיכולים לשרוד את צביעת OsO4 ואת הטבעה Epon פותחו 8,9,10,11. זה מאוד מקדם את הפיתוח של CLEM.
ישנם שלושה היבטים עיקריים ל- Epon לאחר הטמעת CLEM. הראשון הוא חלבון פלואורסצנטי, אשר אמור לשמור על האות הפלואורסצנטי לאחר הכנת דגימת EM. על פי הניסיון שלנו, mScarlet עדיף על חלבונים פלואורסצנטיים אחרים שדווחו. השני הוא כיצד למצוא את אותו תא שצולם על ידי דימות FM בדימות EM. כדי לפתור בעיה זו, אנו משפרים את ההליך עבור שלב זה, כך שניתן למצוא בקלות את תא היעד. האחרון הוא השיטה ליישר את תמונת FM עם תמונת EM. כאן, אנו מפרטים את הרישום בין FM לבין תמונות EM. בפרוטוקול זה, אנו מבטאים mScarlet בתאי עצב VGLUT2 ומדגימים כי mScarlet יכול להתמקד בליזוזומים משניים באמצעות Epon לאחר הטבעה CLEM. אנו מספקים פרטים שלב אחר שלב עבור Epon לאחר הטמעת CLEM, מבלי להתפשר על הפלואורסצנטיות ועל מבנה העל.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המוצג כאן הוא שיטת הדמיה רב-תכליתית, היכולה לשלב את מידע הלוקליזציה של חלבון המטרה ממיקרוסקופ אור (LM) ואת ההקשר סביב חלבון המטרה ממיקרוסקופ אלקטרונים (EM)6. עם המגבלות של חלבונים פלואורסצנטיים הנוכחיים, השיטה הנפוצה היא טרום הטבעה של אור מתאם ומיקרוסקופ אלקטרונים (CLEM),…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרויקט זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32201235 לז’יפיי פו), הקרן למדעי הטבע של מחוז פוג’יאן, סין (2022J01287 לז’יפיי פו), קרן המחקר לכישרונות מתקדמים באוניברסיטה הרפואית פוג’יאן, סין (XRCZX2021013 לז’יפיי פו), הקרן הפיננסית למדע מיוחד של מחוז פוג’יאן, סין (22SCZZX002 לז’יפיי פו), קרן מעבדת המפתח של NHC להערכה טכנית של ויסות פוריות עבור פרימאט לא אנושי, ובית החולים ליולדות ובריאות הילד פוג’יאן (2022-NHP-04 לז’יפיי פו). אנו מודים לליניינג ג’ואו, מינשיה וו, שי לין ויאן הו במרכז השירות לטכנולוגיה ציבורית, האוניברסיטה הרפואית פוג’יאן על התמיכה בהכנת דגימות EM והדמיית EM.
Materials
| 0.2 M Phosphate Buffer (PB) | NaH2PO4 · 2H2O+Na2HPO4 · 12H2O | ||
| 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5) | Shanghai yuanye Bio-Technology | R26284 | |
| 25% Glutaraldehyde (GA) | Alfa Aesar | A17876 | Hazardous chemical |
| Abbelight 3D | Nanolnsights | ||
| Acetone | SCR | 10000418 | |
| Ammonium hydroxide | J&K Scientific | 335213 | |
| BioPhotometer D30 | eppendorf | ||
| Cleaning buffer of cover glasses | 50 mL Ammonium hydroxide, 50 mL Hydrogen peroxide, 250 mL H2O | ||
| Coverglass | Warner | 64-0715 | |
| DABCO | Sigma | 290734 | Hazardous chemical |
| DDSA | SPI company | GS02827 | Hazardous chemical |
| Desktop centrifuge | WIGGENS | MINICEN 10E | |
| Diamond knife | DiATOME | MX6353 | |
| DMP-30 | SPI company | GS02823 | Hazardous chemical |
| DNA transfection reagent | Thermo Fisher | 2696953 | Lipofectamine 3000 Transfection Kit |
| Epon 812 | SPI company | GS02659 | Hazardous chemical |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Fiji image J | National Institutes of Health | ||
| Fixative solution | 4% PFA+0.25% GA+0.02 M PB | ||
| Formvar | Sigma | 9823 | |
| Glycerol | SCR | 10010618 | |
| Gold nanoparticles | Corpuscular | 790120-010 | |
| Gradient resin | Acetone to resin 3:1, 1:1, 1:3 | ||
| Hydrofluoric acid | SCR | 10011118 | |
| Hydrogen peroxide | SCR | 10011218 | |
| ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/) | Easy CLEMv0 Plugin | ||
| Imaging chamber | Thermo Fisher | A7816 | |
| Large gelatin capsules | Electron Microscopy Sciences | 70117 | |
| Mounting buffer | Mowiol 4-88, Glycerol, 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5), DABCO | ||
| Mowiol 4-88 | Sigma | 9002-89-5 | |
| Na2HPO4 ž12H2O | SCR | 10020318 | |
| NaH2PO4 ž2H2O | SCR | 20040718 | |
| NMA | SPI company | GS02828 | Hazardous chemical |
| Oligonucleotide primers | Takara Biomedical Technology (Beijing) | Three oligonucleotides primers were used to detect Vglut2-ires-Cre and wild-type simultaneously. The primers 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, and 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, aimed to detect Vglut2-ires-Cre. The primers 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, and 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3, aimed to detect wild-type. | |
| Oscillating microtome | Leica | VT1000S | |
| Osmium tetroxide | SCR | L01210302 | Hazardous chemical |
| OsO4 solution | 1% Osmium tetroxide+1.5% K4Fe (CN)6·3H2O | ||
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | SCR | 80096618 | Hazardous chemical |
| Perfusion buffer | 4% PFA+0.1 M PB | ||
| Pioloform | Sigma | 63148-65-2 | Hazardous chemical |
| Poly-L-lysine | Sigma | 25986-63-0 | |
| Potassium ferrocyanide (K4Fe (CN)6·3H2O) | SCR | 10016818 | |
| Scalpel blades | Merck | S2771 | |
| Scalpel handles | Merck | S2896-1EA | |
| Stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Transgenic mice | The Jackson Laboratory | Vglut2-ires-Cre mice (strain: 129S6/SvEvTac) were housed in standard conditions (25 °C, a 12 h light/dark cycle, with water and food given ad libitum. Male and Female mice were used at 2–3 months old, weight range 20-30 g. | |
| Transmission electron microscope (TEM) | FEI | TECNAL G2 | |
| UA solution (2% UA) | Aqueous solution | ||
| Ultramicrotome | Leica | LEICA EM UC6 | |
| Uranyl acetate (UA) | TED PELLA | 19481 | Hazardous chemical |
Riferimenti
- de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up. Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
- Kopek, B. G., et al. Diverse protocols for correlative super-resolution fluorescence imaging and electron microscopy of chemically fixed samples. Nat Protoc. 12 (5), 916-946 (2017).
- Watanabe, S., et al. Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy. Nat Methods. 8 (1), 80-84 (2011).
- Johnson, E., et al. Correlative in-resin super-resolution and electron microscopy using standard fluorescent proteins. Sci Rep. 5 (1), 9583 (2015).
- Paez-Segala, M. G., et al. Fixation-resistant photoactivatable fluorescent proteins for CLEM. Nat Methods. 12 (3), 215-218 (2015).
- Fu, Z., et al. mEosEM withstands osmium staining and Epon embedding for super-resolution CLEM. Nat Methods. 17 (1), 55-58 (2020).
- Kukulski, W., et al. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
- Peng, D., et al. Improved fluorescent proteins for dual-colour post-embedding CLEM. Cells. 11 (7), 1077 (2022).
- Campbell, B. C., Paez-Segala, M. G., Looger, L. L., Petsko, G. A., Liu, C. F. Chemically stable fluorescent proteins for advanced microscopy. Nat Methods. 19 (12), 1612-1621 (2022).
- Tanida, I., et al. Two-color in-resin CLEM of Epon-embedded cells using osmium resistant green and red fluorescent proteins. Sci Rep. 10 (1), 21871 (2020).
- Tanida, I., Kakuta, S., Oliva Trejo, J. A., Uchiyama, Y. Visualization of cytoplasmic organelles via in-resin CLEM using an osmium-resistant far-red protein. Sci Rep. 10 (1), 11314 (2020).
- MacManus, D. B. Excision of whole intact mouse brain. MethodsX. 10, 102246 (2023).
- Lu, X., et al. Preserving extracellular space for high-quality optical and ultrastructural studies of whole mammalian brains. Cell Rep Methods. 3 (7), 24 (2023).
- Paul-Gilloteaux, P., et al. eC-CLEM: flexible multidimensional registration software for correlative microscopies. Nat Methods. 14 (2), 102-103 (2017).
- Fenno, L. E., et al. Comprehensive dual- and triple-feature intersectional single-vector delivery of diverse functional payloads to cells of behaving mammals. Neuron. 107 (5), 836-853 (2020).
- Shcherbo, D., et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochem J. 418 (3), 567-574 (2009).
- Shen, Y., Chen, Y., Wu, J., Shaner, N. C., Campbell, R. E. Engineering of mCherry variants with long Stokes shift, red-shifted fluorescence, and low cytotoxicity. PLoS One. 12 (2), e0171257 (2017).
- Ai, H. W., Olenych, S. G., Wong, P., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Hue-shifted monomeric variants of Clavularia cyan fluorescent protein: identification of the molecular determinants of color and applications in fluorescence imaging. BMC Biol. 6 (13), 1741 (2008).
- Ogoh, K., et al. Dual-color-emitting green fluorescent protein from the sea cactus Cavernularia obesa and its use as a pH indicator for fluorescence microscopy. Luminescence. 28 (4), 582-591 (2013).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Xu, P., Xu, T., Zhang, M., Fu, Z., He, W. A protocol for Epon-embedding-based correlative super-resolution light and electron microscopy. Research Square. , (2019).
- Johnson, E., Kaufmann, R. Preserving the photoswitching ability of standard fluorescent proteins for correlative in-resin super-resolution and electron microscopy. Methods Cell Biol. 140, 49-67 (2017).
- Zhou, S., et al. Liquid-liquid phase separation mediates the formation of herpesvirus assembly compartments. J Cell Biol. 222 (1), 17 (2023).
- Tao, C. L., et al. Differentiation and characterization of excitatory and inhibitory synapses by cryo-electron tomography and correlative microscopy. J Neurosci. 38 (6), 1493-1510 (2018).
