3D-utskrift på mikrometerskala muliggjør rask prototyping av polymere enheter for nevroncellekulturer. Som et prinsippbevis ble strukturelle forbindelser mellom nevroner begrenset ved å skape barrierer og kanaler som påvirket nevrittutvekst, mens de funksjonelle konsekvensene av slik manipulasjon ble observert ved ekstracellulær elektrofysiologi.
Nevrale kulturer har vært en referanseeksperimentell modell i flere tiår. Imidlertid mangler 3D-cellearrangement, romlige begrensninger på nevrittutvekst og realistisk synaptisk tilkobling. Sistnevnte begrenser studiet av struktur og funksjon i sammenheng med compartmentalization og reduserer betydningen av kulturer i nevrovitenskap. Tilnærming ex vivo det strukturerte anatomiske arrangementet av synaptisk tilkobling er ikke trivielt, til tross for at det er nøkkelen til fremveksten av rytmer, synaptisk plastisitet og til slutt hjernens patofysiologi. Her brukes to-foton polymerisasjon (2PP) som en 3D-utskriftsteknikk, noe som muliggjør rask fremstilling av polymere cellekulturanordninger ved bruk av polydimetylsiloksan (PDMS) på mikrometerskala. Sammenlignet med konvensjonelle replikastøpeteknikker basert på mikrofotolitografi, muliggjør 2PP-mikroskalautskrift rask og rimelig behandling av prototyper. Denne protokollen illustrerer design og fabrikasjon av PDMS-baserte mikrofluidiske enheter rettet mot dyrking av modulære nevrale nettverk. Som et prinsippbevis presenteres en tokammerenhet for å fysisk begrense tilkoblingen. Spesielt favoriseres en asymmetrisk aksonal utvekst under ex vivo-utvikling og får lov til å bli rettet fra det ene kammeret til det andre. For å undersøke de funksjonelle konsekvensene av ensrettede synaptiske interaksjoner, velges kommersielle mikroelektrodearrayer for å overvåke den bioelektriske aktiviteten til sammenkoblede nevronmoduler. Her illustreres metoder for å 1) fremstille former med mikrometerpresisjon og 2) utføre in vitro multisite ekstracellulære opptak i rottekortikale nevronkulturer. Ved å redusere kostnader og fremtidig utbredt tilgjengelighet av 2PP 3D-utskrift, vil denne metoden bli mer og mer relevant på tvers av forskningslaboratorier over hele verden. Spesielt innen nevroteknologi og nevrale dataopptak med høy gjennomstrømning, vil enkelheten og hurtigheten av prototyping forenklet in vitro-modeller forbedre eksperimentell kontroll og teoretisk forståelse av in vivo storskala nevrale systemer.
Å undersøke nevronaktivitet i atferdsorganismer byr på flere utfordringer. For eksempel er fysisk tilgang til hjernevevet begrenset av behovet for å opprettholde sin integritet, slik at hjernens overfladiske regioner lettere vurderes. Å isolere spesifikke mål i det intakte vevet er ofte en skremmende oppgave og noen ganger umulig. Selv om dissosierte homogene nevronkulturer gir praktisk tilgang til molekylære, biokjemiske og biofysiske egenskaper til individuelle (sub) cellulære komponenter i en nevral krets, går en realistisk tilkobling og anatomisk organisering av den intakte hjernen tapt. Disse grunnleggende begrensningene inspirerte forskningsinnsatsen for å oppnå en middelvei, hvor in vivo kompleksitet unngås mens strukturen kan konstrueres in vitro, som er på forespørsel 1,2,3,4,5,6,7,8,9. Spesielt har modulære nevronkulturer vært gjenstand for omfattende forskning de siste tiårene, med sikte på å takle viktige spørsmål om hjernefysiologi som beskrevet nedenfor.
Organisering: In vivo studier viser at hjernen er strukturert anatomisk i lag med presise celletyper og matriser av projeksjoner. Funksjonelle analyser avslørte organiseringen av nevrale nettverk i nodesamlinger og moduler, med presise tilkoblingsskjemaer10,11. Rollen til tilkobling og mikrokretsmotiver kan imidlertid ikke studeres tilstrekkelig in vivo på grunn av det store antallet synapser som er involvert, samt de sammenvevde effektene av utvikling og aktivitetsavhengig plastisitet.
Signaloverføring: In vivo eller tilfeldige in vitro-kulturer er det utfordrende å vurdere signaloverføring. Undersøkelse av aksonal ledning og aksjonspotensial langs lengden krever veiledende nevrittutvekst ved overflatefunksjonalisering eller kjemisk mønster, noe som gir et høyt signal-støy-forhold i ekstracellulære avlesninger av elektrisk aktivitet12.
Translasjonell relevans: Dekryptering av den eksklusive rollen til pre- versus postsynaptiske elementer på tvers av patologiske forhold krever å ha tilgang til disse elementene individuelt. Modulære kulturer med begrenset tilkobling, som effektivt skiller de pre- og postsynaptiske elementene, er uunnværlige verktøy for dette formålet13.
Det finnes flere metoder for å oppnå en form for struktur i nevronkultur. De kan grovt kategoriseres som kjemisk og fysisk overflatemanipulasjon9. De tidligere metodene 14,15 er avhengige av tilbøyeligheten til nevronceller til å feste seg til visse (bio)kjemiske forbindelser. Dette krever deponering av lim eller attraktive molekyler på en overflate med mikroskala presisjon og etter et detaljert mønster. Selv om dette tillater en delvis dekning av overflaten av cellene, etter ønsket mønster, er kjemiske metoder iboende begrenset og har en relativt lav suksessrate i nevrittvekstveiledning16. Full kontroll over aksondireksjonalitet krever etablering av en romlig gradient av ad-hoc-kjemikalier for å forme aksonal veiledning17. Sistnevnte metoder involverer fysisk overflatemanipulering og brukes oftere til å strukturere nevrale nettverk in vitro. Nevrale celler er fysisk begrenset på ønskede steder av geometriske begrensninger, for eksempel mikroskopiske kamre, vegger, kanaler, etc., og former en biokompatibel polymer som polydimetylsiloksan (PDMS) 3,5,6,7,18,19,20 herdet og størknet til en mikrofluidisk enhet. De facto-metoden for PDMS-mikrofluidisk fabrikasjon er myk fotolitografi21, hvor en todimensjonal maske er mønstret i mikroskala og ansatt for selektivt å etse et silisiumbasert materiale ved UV-eksponering. I et nøtteskall er en UV-herdbar harpiks (dvs. fotoresist) belagt på en silisiumskive gjennom spinnbelegg, og når en bestemt høyde bestemt av viskositeten og spinnhastigheten. Deretter plasseres den mønstrede masken over fotoresisten og utsettes for UV-lys. Transparente områder i masken, tilsvarende interesseområder, vil la UV-lys indusere lokalisert tverrbinding av fotoresistmolekylene. Områdene med ueksponert fotoresist vaskes bort ved hjelp av et løsningsmiddel, noe som resulterer i dannelsen av en hovedform. Dette brukes gjentatte ganger til å bake en valgfri elastomer (dvs. PDMS), som deretter graveres med ønsket geometri i så mange replikaer som ønsket. En slik produksjonsmetode er den vanligste metoden for å fremstille mikrofluidiske enheter22. Kanskje de viktigste begrensningene i myk fotolitografi er forutsetningen for bemerkelsesverdige kapitalinvesteringer og ukjentheten til biologiske laboratorier med de nødvendige teknikkene og kompetansen. Utarbeidelsen av masken og trinnene i myk fotolitografi som kreves for å designe komplekse geometrier med høyt sideforhold i flere høyder, er ikke-trivielle23 og krever ofte outsourcing. Selv om alternative og lavbudsjettsmetoder har blitt foreslått, tilfredsstiller de ikke alltid de høye presisjonskravene til biologisk prototyping24.
Her presenteres en alternativ produksjonsmetode, avhengig av to-foton polymerisasjon (2PP) og additiv produksjon. Det er enkelt og krever ikke i seg selv avansert mikrofabrikasjons- og mikrofotolitografikompetanse. Forskningsfeltet 2PP mikroproduksjon dukket opp på slutten av 90-tallet25, og siden da har det vært vitne til eksponentiell vekst26. Mer om de grunnleggende prinsippene i denne teknikken finner du andre steder26. Kort sagt, ved å fokusere eksitasjonslysimpulsen i tredimensjonalt rom, utnytter 2PP den ikke-lineære avhengigheten av multifotonabsorpsjon på intensitet. Dette gir mulighet for begrenset absorpsjon, noe som sikrer presis og selektiv eksitasjon innenfor svært lokaliserte regioner. I hovedsak blir en negativtonefotoresist, et materiale med nedsatt løselighet ved lyseksponering, utsatt for en fokusert stråle av femtosekund laserpulser ved en lav driftssyklus27. Dette muliggjør impulser med høye intensiteter ved lave gjennomsnittlige effekter, noe som muliggjør polymerisering uten å skade materialet. Samspillet mellom fotoinduserte radikale monomerer gir opphav til radikale oligomerer, initierende polymerisasjon som strekker seg gjennom fotoresisten opp til et distinkt volum, dvs. voxel, hvis størrelse avhenger av intensiteten og varigheten av laserpulser28.
I dette arbeidet presenteres to komponenter: A) design og rask fabrikasjon av en 3D-trykt form, gjenbrukbar mange ganger for å produsere engangspolymere nevroncellekulturenheter (figur 1), og B) deres mekaniske kobling på overflaten av plane nevroncellekultursubstrater, eller til og med av substratintegrerte mikroelektrodearrayer som er i stand til multisiteopptak av bioelektriske signaler.
Computer Assisted Design av en 3D mekanisk modell er veldig kort beskrevet her og ledsaget av trinnene som fører til en 3D-trykt mold og fabrikere PDMS-enheter er også detaljert.
En rekke dataassisterte designprogrammer kan brukes til å generere den startende 3D-objektmodellen og produsere en STL-fil for å kontrollere 2PP-utskriftsprosessen. I materialfortegnelsen er den første og den siste søknaden som er oppført, gratis eller utstyrt med en gratis lisens. Å konstruere en 3D-modell krever alltid å lage en 2D-skisse, som deretter ekstruderes i påfølgende modelleringstrinn. For å demonstrere dette konseptet er en generisk 3D CAD-programvaredesignprosess uthevet i protokolldelen, noe som fører til en struktur laget av overlappende kuber. For mer omfattende informasjon er en rekke elektroniske opplæringsprogrammer og gratis opplæringsressurser tilgjengelige, som angitt i materialfortegnelsen.
Den resulterende STL-filen blir deretter oversatt til en serie kommandoer som skal utføres av 3D-skriveren (dvs. kutteprosedyre). For den spesifikke 2PP 3D-skriveren som brukes, brukes programvaren DeScribe til å importere STL-filen og konvertere den til det proprietære General Writing Language (GWL) -formatet. Suksessen til 2PP-utskriftsprosessen er avhengig av forskjellige parametere, spesielt laserkraft og skannehastighet, søm og klekke-kutteavstander. Valget av disse parametrene, sammen med valg av objektiv og fotoresist, avhenger av designens minste funksjoner, samt den tiltenkte applikasjonen. Dermed blir parameteroptimalisering avgjørende for å oppfylle kravene til forskjellige designscenarier og brukstilfeller. For dette arbeidet har den anbefalte oppskriften IP-S 25x ITO Shell (3D MF) blitt vurdert som en konfigurasjon for utskriftsparametrene. Til syvende og sist skrives en mekanisk stabil trykt del ut med den nødvendige oppløsningen samtidig som 3D-utskriftstiden minimeres.
Formdesignet og tilhørende STL-fil, demonstrert i dette arbeidet, består av en firkantet ramme for å skille rommet til en cellekultur i to rom: et ytre område (dvs. referert til som kilde senere) og et indre område (dvs. referert til som Target senere). Disse to rommene er forbundet gjennom sett med mikrokanaler, hver preget av skarpvinklede grenser, designet for å spesifikt hindre veksten av nevritter fra målet til kilden, men ikke omvendt, og som sådan fremme en retningsbestemt synaptisk forbindelse mellom nevroner som vokser på de to områdene.
Tidligere studier benyttet forskjellige geometrier av mikrokanaler for å oppmuntre til retningsbestemt vekst av nevritter. Eksempler er trekantede former18, kanalpiggstrukturer19 og avsmalnende kanaler20. Her benyttes et design med skarpe vinkelbarrierer over mikrokanalens grenser, også preget av asymmetriske innganger. Disse mikrokanalene tjener til å etablere kontinuitet mellom et lukket interiør, målrommet og det ytre området, kilderommet. Traktformen til den første delen av mikrokanalene, fra kildesiden, er utformet for å fremme dannelsen av aksonale bunter og deres vekst langs den korteste, dvs. rette linjen, banen som forbinder kilden til målet. Det trekantede rommet som realiseres ved å vende mot skarpe vinkler, har større volum på målsiden for å sikte på effektivt å forsinke nevrittenes veifinning, samtidig som det favoriserer rask skyting av bunter som stammer fra kilden og okkupasjonen av den tilgjengelige plassen. Valget av 540 μm for lengden på mikrokanalene filtrerer effektivt ut den generelt kortere dendrittiske utveksten39. I tillegg forhindrer deres høyde på 5 μm cellesomata i å trenge gjennom mikrokanalene. Samlet sett viste denne konfigurasjonen seg å fremme ensrettet tilkobling mellom de ytre, kilde- og indre målmodulene, og den presenteres her som et prinsippbevis blant de mange alternative valgene.
Mens PDMS-enhetene, fremstilt av 2PP-formen, kan festes til overflaten av vanlige cellekultursubstrater, for eksempel glassdeksler eller petriskåler, ble det i dette arbeidet brukt kommersielt tilgjengelige substratintegrerte mikroelektrodearrayer. Ingen innsats har blitt gjort for å optimalisere 3D-designet til mikroelektrodeoppsettet, og den mekaniske koblingen ble utført under stereomikroskopiveiledning som bare tok sikte på å plassere enheten over matrisen, slik at noen mikroelektrode ble avdekket i begge sider, kilden og målet. Dette muliggjør en foreløpig vurdering av de funksjonelle konsekvensene av den begrensede tilkoblingen i nevroncellekulturer.
Til tross for at den er flere tiår gammel, er anvendelsen av 2PP-teknologi i mikrometerskala PDMS-basert replikastøping en nylig utvikling43,44. I denne sammenheng diskuteres en rekke punkter nedenfor for å hjelpe brukerne med å effektivt reprodusere dette arbeidet.
For 3D-modelldesign må du sørge for at modellen ikke har hull eller selvskjæringspunkter. Gi privilegier til det binære filformatet når du lagrer som STL, for det mindre filstørrelsesfotavtrykket enn ASCII-kodet. Dette er spesielt nyttig for design med intrikate geometrier og for milliliterbrede objekter. Bruk av binære STL-filer innebærer også lav CPU-belastning, senere i prosessen forbereder den mekaniske delen som skal 3D-printes. Funksjonenes fysiske dimensjoner i STL-filen er representert i dimensjonsløse enheter. Under etterbehandling av STL-filen tolkes enheter som mikrometer. Derfor anbefales det å ta i bruk interesseenheten på forhånd, dvs. mikrometer, når du forbereder filen. Nøyaktigheten til den trykte modellen bestemmes av antall overflater som tilnærmer seg tessellerte trekanter. For et utilstrekkelig antall overflater vil uønsket overflateruhet oppstå. Ikke desto mindre kommer sikte på for høy nøyaktighet av et veldig stort antall overflater til prisen av en høy beregningsbelastning, noe som fører til at filbehandlingen blir treg.
For 3D-utskrift, under utskrift, dannes det fysiske 3D-objektet ved hjelp av rask galvo-skanning i x-y-planet og piezobevegelse i z-retningen. Dette fokuserer femtosekund laserstrålen innenfor en gitt 3D voxel. Men når utskriftsstrukturer er større enn galvoens og piezoens romlige dekningsområder, må objektet programmatisk deles inn i blokker. Selv om dette er et krav for millimeterstore trykte deler, er kryss mellom blokker knyttet til (ufullkomne) sømlinjer. Nøye optimalisering av blokkantall og plassering av sømlinjer i x-, y- og z-retninger er avgjørende for å unngå å forstyrre kritiske geometriske trekk ved det endelige objektet med sømlinjer. Bobler kan dannes ved utskriftsgrensesnittet av ulike årsaker (f.eks. substrater fotoresistens urenheter og inhomogeniteter), og negativt påvirke kvaliteten og integriteten til den trykte strukturen. Videre kan høyere lasereffekt føre til en økning i forekomsten. Å redusere lasereffekten, på det laveste laget av den trykte delen, vil minimere sjansene for bobledannelse. Som et alternativ til å trykke hele delen som en solid struktur, kan skall- og stillasmetode vurderes. Det innebærer bare å skrive ut den ytre overflaten av delen (skallet), samt trekantede prismeelementer i den. Disse elementene er adskilt av horisontale lag (stillas), som holder den upolymeriserte harpiksen i små lommer. Denne metoden forkorter utskriftstiden betydelig, noe som er spesielt relevant for millimeterstore strukturer. Imidlertid, da ikke-polymerisert harpiks forblir, er UV-eksponering etter utskrift avgjørende for å sikre full mekanisk stabilitet, selv om dette trinnet må utføres forsiktig for å unngå deformasjon av den trykte delen. Tiden etter herding avhenger av hvilken harpiks du velger, delens tykkelse og UV-effekt40. For optimale resultater anbefales det å gjennomføre en innledende prøve for å estimere tiden som trengs for full dybdeherding, ved hjelp av en dråpe fotoresist og evaluering av snittsnittet etter UV-eksponering. Den vanlige herdeperioden varierer mellom 5 og 20 minutter.
For PDMS-replikastøping kan ren fabrikasjon av en PDMS-enhet med mikrometerskalafunksjoner, uten renromsfasiliteter, være utfordrende: luftbårne mikropartikler kan ligge på den svært klebende overflaten av PDMS og hindre forseglingen mellom enheten og substratet, eller blokkere delen av individuelle mikrokanaler. Utførelse av protokolltrinnene under en avtrekkshette for laminær luftstrøm og konsekvent skjerming av PDMS-overflaten med isopropanol minimerer risikoen for kontaminering betydelig. Herdetemperaturen og dens varighet påvirker direkte PDMS-tverrbindingen og de resulterende fysiske egenskapene. Spesielt er klebeevnen til herdet PDMS en kritisk faktor. På den ene siden er det nødvendig med en tett forsegling mellom PDMS-enheten og overflaten som brukes til nevroncelledyrking (f.eks. Et glassdeksel eller en MEA), for effektivt å begrense passasjen av nevrittene. På den annen side skal PDMS-enheten festes til overflaten reversibelt, slik at det delikate isolerende laget MEA ikke blir skadet etter at enheten er fjernet. Mens PDMS-krymping under herding oppstår og kan korrigeres ved forhåndsskalering av formen, vil krymping for temperaturer og herdeintervaller som er angitt her, være mindre enn 2%42 og vil ikke påvirke signifikant, enkeltlags PDMS-enheter. Totalt sett må du følge de anbefalte verdiene for herdetemperatur og varighet nøyaktig for de beste resultatene.
Oversikt over fordeler og begrensninger ved metoden
En teknikk basert på 2-foton direkte laserskriving foreslås for rask fabrikasjon av polymere enheter i mikroskala for eksperimentell studie av modulære nevrale nettverk. I motsetning til myk fotolitografi krever den foreslåtte tilnærmingen ikke et høyt nivå av teknisk ekspertise, forutsatt at et funksjonelt 2PP 3D-utskriftsoppsett er tilgjengelig og operativt. Bemerkelsesverdig nok gjør metoden det mulig å gå fra en CAD-designet 3D-modell til en funksjonell PDMS-enhet i løpet av en enkelt dag, og gir dermed en direkte og effektiv vei fra konsept til konkret realisering. Spesielt reduserer valg av skall-og-stillas-utskriftsmodus betydelig tiden som trengs for å lage formen, da bare en brøkdel av volumet skrives ut. Etterfølgende UV-herding av den trykte komponenten garanterer mekanisk stabilitet og robusthet, som verifisert her over 50 støpesykluser med PDMS.
Sammenlignet med tradisjonelle metoder har 2PP 3D-utskrift en klar fordel, noe som er mest uttalt når det gjelder fremstilling av former med et betydelig sideforhold, krevende oppløsningskrav og komplekse tredimensjonale geometrier. Produksjonen av masterformer ved bruk av standard UV-litografi er begrenset av en motstandstykkelse på ca. 200 μm. Intrikate sekvenser av spinnbelegg og eksponeringssykluser35, kostbare LIGA (litografi, galvanisering og støping) eller dyp reaktiv ionetsing (DRIE) prosesser36 er nødvendige for å oppnå større høyde- og aspektforhold. I skarp kontrast, som demonstrert i pionerarbeidet til Kumi et al. i 201037, tilbyr 2PP-teknikken et i hovedsak ubegrenset omfang for størrelsesforholdet mellom de trykte delene, som spenner fra submikrometer til millimeter. Her har mikroproduksjonsprosessen til en form med betydelig forskjell i høyde på delene blitt eksemplifisert, med over 100 ganger forskjell mellom mikrokanalenes høyde (5 μm og maksimal mugghøyde (545 μm; se figur 2).
Submikrometeroppløsning kan også lett oppnås ved å følge protokollspesifikasjonene som er skissert. Til sammenligning krever det kapitalinvesteringer å oppnå forbedrede muggoppløsninger gjennom UV-fotolitografi. Maskene med den fineste oppløsningen, som benytter kromavsetning på kvarts med en nominell oppløsning på 600 nm, er priset flere størrelsesordener høyere enn de lasertrykte overheadgjennomsiktighetsmaskene, som har en oppløsning på 250 μm35, men se arbeidet til Pirlo et al.41. For å være levedyktig for intern bruk, må en valgt metode være kostnadseffektiv. For mange biologiske laboratorier utgjør den totale kostnaden forbundet med konvensjonell myk fotolitografi eller direkte laserskriving en barriere. Selv om det er mulig å gjøre begge teknologiene mer tilgjengelige ved å kjøpe og montere de essensielle komponentene, krever denne tilnærmingen ytterligere ekspertise og krever fortsatt en betydelig investering. I denne sammenheng er et viktig poeng å vurdere det bredere spekteret av applikasjoner som kan oppnås gjennom direkte laserskriving. I motsetning til konvensjonell myk fotolitografi, hovedsakelig begrenset til formmikroproduksjon, viser 2PP 3D-utskrift bemerkelsesverdig allsidighet. Dens potensielle bruksområder spenner fra mikrofluidikk og mikrooptikk til integrert fotonikk og mikromekanikk. Dette gjør investering i denne teknologien attraktivt som et felles anlegg for flere og mangfoldige vitenskapelige felt. For eksempel er den 2PP-baserte metodikken utviklet i denne protokollen resultatet av et tverrfaglig samarbeid mellom nevrovitenskap og matematikkavdelinger i vår institusjon. I tillegg er fotoresistutviklingen et aktivt forskningsfelt, og kan potensielt utvide bruksområdet for 2PP 3D-utskrift. Et eksempel på dette er den nylige introduksjonen av IP-PDMS-harpiks. Ved polymerisering til strukturer med egenskaper som PDMS38, låser denne harpiksen opp potensialet for direkte mikrofabrikasjon av biokompatible komponenter som har kronglete overflater eller inneholder hulrom. Disse vanskelighetene står som barrierer for å oppnå lignende resultater gjennom konvensjonelle replikastøpingsprosedyrer.
Som en demonstrasjon av denne metoden ble det gitt bevis som tyder på utvikling av ensrettet tilkobling mellom to moduler i et modulært nevronnettverk. Mikroskalaformen, produsert av 2PP-teknikk, hadde nok utholdenhet til å gjennomgå flere PDMS-støping, og har den nødvendige mikroskalapresisjonen. Avslutningsvis strekker anvendelsesområdet for protokollen beskrevet i dette arbeidet utover det illustrerte tilfellet. Etter hvert som tilgangen til 2PP-utskriftsteknologien blir stadig mer utbredt, vil den opprinnelige investeringen som kreves for implementeringen reduseres, mens utvalget av potensielle applikasjoner utvides.
The authors have nothing to disclose.
MG anerkjenner økonomisk støtte fra EUs H2020 rammeprogram gjennom European Innovation Council (IN-FET-prosjektet, GA n. 862882, Arbor-IO-prosjektet, FLAG-ERA og Human Brain Project, ID 650003) og fra Sissa (Neuroscience Area). GN anerkjenner økonomisk støtte fra det italienske departementet for universitet og forskning (MUR) gjennom tilskuddet Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 (matematikkområde). Vi takker M. Gigante, B. Pastore og M. Grandolfo for deres hjelp med 3D-utskrift, celledyrking og live-imaging, samt Dr. P. Massobrio, P. Heppenstall, L. Ballerini, Di Clemente og H.C. Schultheiss for diskusjoner. Finansiørene hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om publisering eller utarbeiding av manuskriptet.
2-Propanol | Sigma-Aldrich | 650447 | |
BB cure compact polymerizer | PCube Srl | Wavelengths 365-405 nm, Power 120W | |
BioMed Amber Resin 1 L | formlabs | Resin used for mounting the 3D Printed mold to Petri dish | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
CAD application software SolidWorks | Dassault Systèmes SolidWorks Corporation, US | Fusion 360 (Autodesk Inc., US), AutoCAD (Autodesk Inc., US), PTC Creo (PTC corp., US), SolidWorks (Dassault Systèmes SolidWorks corp., US) and Tinkercad (Autodesk Inc., US). ————————————– Tutorials: https://www.mycadsite.com/tutorials.html Trainings: https://www.autodesk.com/training |
|
CellTracker Green CMFDA | Invitrogen | C7025 | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
D-AP5 | Tocris | #0106 | |
Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | D5025 | |
DeScribe | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
di-Sodium hydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 106585 | |
Gentamicin | Thermo Fisher | 15710049 | |
Hanks′ Balanced Salts | Sigma-Aldrich | H2387 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | |
Horse Serum | Sigma-Aldrich | H1138 | |
in vitro MEA recording system MEA2000 mini | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | ||
IP-S Photoresist | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
Kynurenic acid | Sigma-Aldrich | K3375 | |
L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | |
MEA recording application software (Experimenter) | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | ||
Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | 51412C | |
NanoWrite | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
ophthalmic stab Knife 15° | HESTIA Medical | ||
Photonic Professional GT2 (PPGT2) 3D printer | Nanoscribe GmbH & Co. KG | SN617 | |
Plasma Cleaner | HARRICK PLASMA | ||
Poly(ethyleneimine) solution | Sigma-Aldrich | P3143 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
Propylene glycol methyl ether acetate (PGMEA) | Sigma-Aldrich | 484431 | |
Repel-silane ES | Sigma-Aldrich | GE17133201 | |
Soda lime ITO-coated substrates for 3D MF DiLL | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
Substrate-integrated planar MEAs (120MEA100/30iR-ITO-gr) | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | TiN electrodes, SiN isolator, 4 internal reference electrodes,120 recording electrodes, Electrode spacing 100 µm,Electrode diameter 30 µm | |
SYLGARD 184 Kit | Dow Corning | ||
Trypsin | Sigma-Aldrich | T1005 | |
Trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T9003 | |
vacuum pump Single phase asynchronous 2 poles | CIMAMOTORI |