L'obiettivo di questo documento è quello di descrivere in dettaglio le migliori pratiche per la produzione di terreni per microrganismi anaerobici fastidiosi acquisiti da un ambiente. Questi metodi aiutano a gestire le colture anaerobiche e possono essere applicati per supportare la crescita di microrganismi non coltivati elusivi, la "materia oscura microbica".
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Articolo metodologico
Un insieme di mezzi di comunicazione simulati informati in situ per la coltura di microrganismi anaerobici acquisiti nell'ambiente
In questo articolo
Sommario
Abstract
La ricerca sui microrganismi anaerobi dipendente dalla coltura si basa sulla competenza metodologica. Questi metodi devono creare e mantenere condizioni di crescita adeguate (ad esempio, pH e fonti di carbonio) per i microrganismi anaerobici, consentendo al contempo l'estrazione di campioni senza compromettere l'ambiente artificiale. A tal fine, i metodi che si basano e simulano un ambiente in situ possono essere di grande aiuto nella coltura di microrganismi provenienti da quell'ambiente. Qui, descriviamo un metodo anaerobico in situ informato e simulato per la coltura di microrganismi terrestri superficiali e sotterranei, enfatizzando la raccolta di campioni anaerobici con perturbazioni minime. Questo protocollo descrive in dettaglio la produzione di un mezzo liquido anaerobico personalizzabile e l'acquisizione ambientale e la crescita in vitro di microrganismi anaerobici. Il protocollo copre anche i componenti critici di un bioreattore anaerobico utilizzato per simulazioni ambientali di sedimenti e mezzi liquidi anaerobici per colture acquisite in ambiente. Abbiamo incluso i dati preliminari di sequenziamento di nuova generazione da un microbioma mantenuto per tutta la durata di vita di un bioreattore in cui la coltura attiva si è regolata dinamicamente in risposta a una fonte sperimentale di carbonio.
Introduzione
La maggior parte dei microrganismi rimane non coltivata; Ciò è supportato dalla grande disparità tra le cellule osservata attraverso la microscopia, contrastata dai pochi microrganismi coltivati con successo utilizzando piastre di agar. Staley e Konopka chiamarono questa disparità "Anomalia del Conteggio delle Grandi Placche"1. La diversità stimata non contabilizzata è supportata da dati metagenomici e metatrascrittomici che mostrano molti nuovi generi distribuiti in curve di abbondanza di rango provenienti da diversi ambienti2. I microrganismi che sono stati osservati (generalmente mediante sequenz....
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Protocollo
1. Produzione di mezzo liquido anaerobico personalizzabile
- Terreno per flaconi di coltura (produzione di 500 ml)
- Misurare e aggiungere composti in un flacone da 1 L e regolare il pH utilizzando la colonna nella Tabella 1 corrispondente alla cultura di interesse del lettore (le quantità nella Tabella 1 sono registrate per una produzione di 1.000 mL, regolare di conseguenza). Mescolare i composti fino a ottenere omogeneità facendo roteare la bottiglia.
- Riscaldare il liquido fino all'ebollizione cuocendo la bottiglia nel microonde per 5-6 minuti. Aprire spesso il microonde e far roteare delica....
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Risultati
Qui mostriamo i risultati di uno studio su un bioreattore utilizzando un metodo di preparazione del terreno di coltura misto in foro e un metodo di configurazione del bioreattore come descritto di seguito. Il terreno di coltura misto del pozzo è stato modificato per contenere come fonte di carbonio un liquame di pannocchie di mais processate mediante dissoluzione idrotermale ossidativa (OHD)13,14. Il terreno di coltura misto modificato è stato pompato nel bioreat.......
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Discussione
La sezione di produzione media di questo protocollo (sezione 1) deve la sua struttura alla tecnica Hungate modificata di Miller e Wolin17, che è stata ampiamente utilizzata sin dalla sua pubblicazione. La praticità di questo protocollo ampliato deriva dalla sua natura descrittiva e dall'abbinamento con l'acquisizione in situ di microrganismi. I flaconi di coltura contenenti terreni informati e simulati dal punto di vista ambientale sono stati utilizzati per coltivare con successo i seguen.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Gli autori vorrebbero riconoscere il lignaggio di informazioni e tutoraggio che ha influenzato/evoluto queste tecniche nel corso degli anni. Il Dr. Hamilton-Brehm come ex studente laureato, postdoc e attuale professore ha un debito di gratitudine nei confronti di coloro che si sono presi il tempo di insegnare le tecniche anaerobiche: il Dr. Mike Adams, il Dr. Gerti Schut, il Dr. Jim Elkins, il Dr. Mircea Podar, il Dr. Duane Moser e il Dr. Brian Hedlund. The Nature Conservancy e American Rivers hanno sostenuto questo lavoro attraverso le sovvenzioni G21-026-CON-P e AR-CE21GOS373, rispettivamente. Tutte le opinioni, i risultati, le conclusioni o le raccomandazioni espre....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| General Materials | |||
| Flacone di borosillicato da 1 L | Fisher Scientific | ||
| da 1 ml con punta scorrevole | Pipetta in vetro Fisher Scientific | ||
| Flacone per coltura da 100 mL | Fisher Scientifc | ||
| Crimpatrice manuale da 20 mm | Fisher Scientifc | ||
| Ago da 23 G | Fisher Scientifc | ||
| Flacone in borosilicato da 500 mL | Fisher Scientific | ||
| Sigillo in alluminio | Scientifc | ||
| Cannula, lunghezza 31,5 cm | Fisher Scientific | ||
| , lunghezza 6 cm | Fisher Scientifc | ||
| Corer | Giddings Machine Company | Assemblato da parti dell'azienda | |
| Collettore del gas | Swagelok | Assemblato da molte parti diverse | |
| Accendino | Lowe's | ||
| N2 gas | Airgas | ||
| Guanti in nitrile | Fisher Scientific | ||
| Tappo in gomma (per bombole GL45) | Glasgeratebau OCHS | ||
| Tappo in gomma (per bottiglie di coltura) | Ace Glass | ||
| Piastra riscaldante per agitazione | Corning | ||
| Oligoelementi | ATCC | ||
| Vitamine | ATCC | ||
| strong>Materiali specifici per bioreattore | |||
| #10 Tappo in gomma | Ace Glass | ||
| Tappo in gomma #7 | Siringa Fisher Scientifc | ||
| da 1 ml con punta luer lock | Fisher Scientifc | ||
| Valvola a sfera con portagomma da 1/4" | Siringa Amazon | ||
| da 10 ml con punta luer lock | Fisher Scientifc | ||
| Flacone in borosilicato da 3,5 L | Scientific Adattatore | ||
| portagomma da 5/16" - 1/4" raccordo | Amazon | ||
| 60 mL siringa con punta luer lock | Fisher Scientifc | ||
| 8 L borosillicate damigiana | Allen Glass | ||
| Connettore per tubo angolato per tappo aperto GL14 | Ace Glass | 7623-20 | |
| Balloon | Party City | ||
| Borosillicate bioreattore | Allen Scientific Glass | Su misura su richiesta | |
| Drill | Lowe's | ||
| Femmina luer lock adattatore accoppiatore | Amazon | ||
| GL14 tappo superiore aperto | Ace Glass | 7621-04 | |
| GL18 tappo superiore aperto | Ace Glass | 7621-08 | |
| GL45 tappo superiore aperto | Ace Glass | ||
| PTFE affrontato setto in silicone per tappo superiore aperto GL14 | Ace Vetro | 7625-06 | |
| PTFE affrontato silicone setto per GL18 tappo superiore aperto | Ace Glass | 7625-07 | |
| Ring stand | Scientific | ||
| Ring stand morsetto catena | Amazon | ||
| Ring stand morsetto | Scientific | ||
| Tubo in silicone; 1/4 "id, 1/2" od | Grainger | 55YG13 | |
| Tubo in silicone; 3/16" id, 3/8" od | Grainger | ||
| Connettore per tubo flessibile dritto per tappo superiore aperto GL14 | Ace Glass | 7623-22 | |
| Rubinetto a tre vie | Amazon | ||
| Rubinetto a due vie | Amazon | ||
| Minipompa a flusso variabile a flusso ultra basso | VWR | ||
| Bagnomaria | Fisher Scientifc | ||
| Setto in gomma bianca per tubi diametro esterno 13-18 mm | Ace Glass | 9096-49 | |
| Wire | Lowe's | ||
| Fascetta | Lowe's |
Riferimenti
- Staley, J. T., Konopka, A. Measurement of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats. Annu. Rev. Microbiol. 39 (1), 321-346 (1985).
- Lloyd, K. G., Steen, A. D., Ladau, J., Yin, J., Crosby, L.
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Ristampe e permessi
