Hochdurchsatz-Screening-Bewertung der Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) mit Dihydroethidium (DHE)-Fluoreszenzfarbstoff
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige Methode zur Quantifizierung intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) unter Verwendung von Dihydroethidium (DHE) als Fluoreszenzfarbstoffsonde unter Verwendung eines Hochdurchsatz-Screening-Ansatzes. Das Protokoll beschreibt die Methoden zur quantitativen Beurteilung intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) in den drei verschiedenen hepatozellulären Karzinomzelllinien.
Abstract
Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) spielen eine Schlüsselrolle bei der Regulation des Zellstoffwechsels bei physiologischen und pathologischen Prozessen. Die physiologische ROS-Produktion spielt eine zentrale Rolle bei der räumlichen und zeitlichen Modulation normaler zellulärer Funktionen wie Proliferation, Signalübertragung, Apoptose und Seneszenz. Im Gegensatz dazu ist eine chronische ROS-Überproduktion für ein breites Spektrum von Krankheiten verantwortlich, wie unter anderem Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Diabetes. Die genaue und reproduzierbare Quantifizierung des ROS-Spiegels ist daher für das Verständnis der normalen zellulären Funktionalität unerlässlich. Fluoreszenzbildgebungsbasierte Methoden zur Charakterisierung intrazellulärer ROS-Spezies sind ein gängiger Ansatz. Viele der bildgebenden ROS-Protokolle in der Literatur verwenden 2′-7′-Dichlordihydrofluoresceindiacetat (DCFH-DA)-Farbstoff. Dieser Farbstoff leidet jedoch unter erheblichen Einschränkungen in seiner Verwendung und Interpretierbarkeit. Das aktuelle Protokoll demonstriert die Verwendung einer Dihydroethidium (DHE)-Fluoreszenzsonde als alternative Methode zur Quantifizierung der gesamten ROS-Produktion in einer Hochdurchsatzumgebung. Die Hochdurchsatz-Bildgebungsplattform CX7 Cellomics wurde verwendet, um die ROS-Produktion zu messen und zu quantifizieren. Diese Studie wurde an drei hepatozellulären Krebszelllinien durchgeführt – HepG2, JHH4 und HUH-7. Dieses Protokoll enthält eine detaillierte Beschreibung der verschiedenen Verfahren, die an der Bewertung von ROS in den Zellen beteiligt sind, einschließlich – Herstellung der DHE-Lösung, Inkubation der Zellen mit DHE-Lösung und Messung der DHE-Intensität, die zur Charakterisierung der ROS-Produktion erforderlich ist. Dieses Protokoll zeigt, dass DHE-Fluoreszenzfarbstoff eine robuste und reproduzierbare Wahl ist, um die intrazelluläre ROS-Produktion im Hochdurchsatz zu charakterisieren. Hochdurchsatzansätze zur Messung der ROS-Produktion sind wahrscheinlich in einer Vielzahl von Studien hilfreich, z. B. in der Toxikologie, beim Wirkstoffscreening und in der Krebsbiologie.
Introduction
Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind eine Gruppe natürlich vorkommender, hochreaktiver und zeitlich instabiler chemischer Radikale, die als Teil des normalen Zellstoffwechsels in Zellen gebildet werden. ROS spielt eine wichtige und wesentliche Rolle bei der Modulation normaler physiologischer und biochemischer Prozesse, die in Zellen ablaufen 1,2. Die Hauptquelle der ROS-Produktion in Zellen ist der mitochondriale Elektronentransportkettenweg (ETC) als Teil des normalen bioenergetischen Zyklus. Zu den bedeutenden zusätzlichen Quellen der ROS-Produktion gehören enzymatische Reaktionen wie zelluläre NADPH-Oxidasen in Zellen. Der Stoffwechsel von Nahrungsmolekülen (z. B. Glukose) erfolgt über den oxidativen Phosphorylierungsweg in der mitochondrialen Matrix. Ein Ausgangsniveau der ROS-Produktion ist wichtig, um normale physiologische Zellsignalprozesse zu regulieren. Es ist bekannt, dass viele wichtige Proteinmoleküle, die Teil der metabolischen Glukosesignalwege sind (z. B. Akt und PTEN), auf intrazelluläre ROS-Spiegel reagieren. Darüber hinaus werden ROS von verschiedenen intrazellulären Enzymen wie Xanthinoxidase, Stickstoffmonoxidsynthase und peroxisomalen Bestandteilen als Teil der zellulären enzymatischen Signalwegeproduziert 1,2. Im Gegensatz zu den natürlichen Quellen von ROS führen bestimmte Umweltfaktoren wie Xenobiotika, Infektionserreger, UV-Licht, Umweltverschmutzung, Zigarettenrauchen und Strahlung ebenfalls zu einer übermäßigen Produktion von ROS, die ein Haupttreiber für intrazellulären oxidativen Stress sind 1,3. Erhöhter zellulärer oxidativer Stress kann native Biomoleküle in einer Zelle wie Lipide, Proteine und DNA schädigen und verschiedene Krankheiten wie Krebs, Diabetes, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, chronische Entzündungen und neurodegenerative Erkrankungen verursachen 1,3,4. Daher sind genaue Messungen von ROS unerlässlich, um die zellulären Mechanismen zu verstehen, die an der Pathophysiologie oxidativer Stress-induzierter Krankheiten beteiligt sind.
Aufgrund der kurzen Zeitskalen der ROS-Produktion und -Eliminierung in Zellen bleibt die quantitative Messung verschiedener ROS-Radikale eine Herausforderung. Methoden wie die paramagnetische Elektronenresonanz (EPR)5, Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) und die auf Fluoreszenzsonden basierende Bildgebung werden verwendet, um die verschiedenen zellulären ROS6 zu messen. Während Methoden wie EPR und HPLC quantitativ genaue Schätzungen liefern, beinhalten diese Methoden die Zerstörung der zellulären räumlichen Morphologie und erfolgen in der Regel in Form von Global- und Massenmessungen einer Probe. Im Gegensatz dazu behalten bildgebende Methoden wie Fluoreszenzsonden-basierte Methoden die zelluläre Morphologie und den räumlichen Kontext der ROS-Generation bei. Die Spezifität verschiedener Fluoreszenzsonden für verschiedene Arten von ROS-Radikalen ist jedoch nicht gut belegt 7,8. Mehrere Fluoreszenzsonden wie Dihydroethidium (DHE), Dichlordihydrofluoresceindiacetat (DCFH-DA), Dihydrorhodamin (DHR), Dimethylanthracen (DMA), 2,7-Dichlordihydroflurescein (DCFH), 1,3-Diphenylisobenzofuran (DPBF) und MitoSox sind für den ROS-Nachweis kommerziell erhältlich. In den letzten Jahrzehnten waren DHE, MitoSox und DCFH-DA die am häufigsten verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe zur Messung von ROS in Zellen und Geweben 8,9. DCFH-DA ist ein weit verbreiteter Farbstoff zum Nachweis von intrazellulärem H2O2 und oxidativem Stress. Trotz der Popularität von DCFH-DA haben mehrere frühere Studien gezeigt, dass es nicht zuverlässig zur Messung der intrazellulären H2O2 und anderer ROS-Spiegel verwendet werden kann 8,9,10,11,12,13,14.
Im Gegensatz dazu zeigt die Fluoreszenzsonde Dihydroethidium (DHE) eine spezifische Reaktion auf das intrazelluläre Superoxidradikal (O2–). Während das Superoxidradikal eine von vielen der in Zellen beobachteten ROS-Spezies ist, ist es ein wichtiges Radikal, das unter anderem an der Reduktion von Übergangsmetallen, der Umwandlung in Peroxynitrat und der Bildung von Hydroperoxiden beteiligt ist. DHE wird schnell von den Zellen aufgenommen und hat eine Fluoreszenzemission im roten Wellenlängenbereich15. Bei der spezifischen Reaktion mit Superoxidradikalen bildet DHE ein rot fluoreszierendes Produkt, 2-Hydroxyethidium (2-OH-E+). Daher kann DHE als spezifische Sonde für den Superoxidnachweis betrachtet werden. DHE kann jedoch auch eine unspezifische Oxidation mit ONOO– oder OH, H2O 2 und Cytochrom c durchlaufen, um ein zweites Fluoreszenzprodukt, Ethidium E+, zu bilden, das die gemessenen 2-OH-E+-Spiegel stören kann. Diese 2-OH E+ und E+ Produkte stellen jedoch in Kombination einen großen Teil der gesamten zellulären ROS-Spezies dar, die in einer Zelle beobachtet werden, wenn sie mit DHE gefärbt werden. E+ interkaliert in die DNA und verstärkt deren Fluoreszenz 8,9,10,11,13,14,15,16. Da sich die Fluoreszenzspektren von Ethidium und 2-Hydroxyethidium nur geringfügig unterscheiden, kann der Großteil der ROS-Werte, die in einer Zelle infolge der Superoxidproduktion beobachtet werden, mit DHE-Fluoreszenzprodukten nachgewiesen und gemessen werden. Diese ROS-Spezies werden mit einer Wellenlängenanregung von 480 nm und einer Wellenlängenemission von 610 nm 15,16,17 identifiziert.
Neben der Auswahl einer spezifischen fluoreszierenden ROS-Detektionssonde ist es wichtig, eine empfindliche Nachweismethode zur Messung intrazellulärer ROS zu wählen. Die genaue Beurteilung der intrazellulären ROS-Spiegel ist daher der Schlüssel zur Identifizierung gestörter Redox-Gleichgewichtszustände, die in erkrankten Zellen oder Zellen auftreten, die verschiedenen Umweltstressoren wie Strahlung, toxikologischen Verbindungen und genotoxischen Wirkstoffen ausgesetzt waren18. Da ROS ein häufig auftretendes Phänomen in Zellen ist, das für die Regulierung einer Vielzahl von Zellsignalaktivitäten verantwortlich ist, sind robuste Methoden zum Nachweis von ROS unerlässlich. Um eine solche Hochdurchsatzbewertung der ROS-Produktion innerhalb von Zellen zu ermöglichen, verwendet dieses Protokoll eine High-Content-Screening-Plattform (HCS) zur Messung der ROS-Spezies. Das aktuelle Protokoll ermöglicht die Hochdurchsatzanalyse der intrazellulären ROS-Produktion, die in vielen toxikologischen Studien von entscheidender Bedeutung ist19. Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine einfache und vielseitige Lösung zum Nachweis und zur Messung intrazellulärer ROS in adhärenten hepatozellulären Karzinomzellen bereitzustellen. Die chemischen Reagenzien von H2O2 und Menadion werden als potente ROS-Stimulatoren verwendet, um die relativen Niveaus der ROS-Produktion in einer kontrollierten und hohen Durchsatzeinstellung zu messen. Dieses Protokoll kann bei Bedarf fein abgestimmt werden, um die ROS-Produktion in adhärenten und nicht adhärenten Zellen unter geeigneten Bedingungen zu messen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie wurde ein Protokoll zur Bewertung der superoxidgesteuerten intrazellulären Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) unter Verwendung von Dihydroethidium (DHE)-Fluoreszenzfarbstoff auf einem High-Content-Screening-System erstellt. Ein Großteil der derzeit in der Literatur verfügbaren Protokolle verwendet die DCFH-DA als Fluoreszenz-Bildgebungssonde zur Quantifizierung von ROS-Spezies. Mehrere Studien haben jedoch gezeigt, dass die DCFH-DA keine ideale Sonde für die Messung intrazellulärer ROS…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RK und RRG wurden durch einen Zuschuss des UNM Center for Metals in Biology and Medicine (CMBM) durch den NIH NIGMS-Zuschuss P20 GM130422 unterstützt. RRG wurde durch einen Pilotpreis aus dem NM-INSPIRES P30-Stipendium 1P30ES032755 unterstützt. Die Unterstützung des Bildgebungskerns für das CX7 Cellomics-Instrument wurde durch die AIM-Center-Kerne bereitgestellt, die durch NIH-Zuschüsse P20GM121176 finanziert wurden. Wir danken Dr. Sharina Desai und Dr. Li Chen für ihre unschätzbare Unterstützung bei technischen Fragen im Zusammenhang mit der Verwendung der CX7 Cellomics-Bildgebungsplattform.
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | VWR | 20170-038 | |
| 96- well plate | Corning Costar | 07-200-90 | |
| Cellomics Cx7 | ThermoFisher | HCSDCX7LEDPRO | |
| Collagen | Advanced Biomatrix | 5056 | |
| DHE (Dihydroethidium) | ThermoFisher | D1168 | |
| DMEM | Sigma | 6046 | |
| FBS | VWR | 97068-085 | |
| GraphPad Prism | GraphPad | Version 6.0 | |
| HepG2 cell line | ATCC | ||
| Hoechst | ThermoFisher | 33342 | |
| HUH7 cell line | ATCC | ||
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 88597 | |
| JHH4 cell line | ATCC | ||
| Menadione | Sigma | M5625 |
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