Avaliação de triagem de alto rendimento da geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) usando corante de fluorescência Dihidroetídio (DHE)

Summary

Este protocolo descreve um novo método para quantificar espécies reativas de oxigênio (ROS) intracelulares usando diidroetídio (DHE) como sonda de fluorescência usando uma abordagem de triagem de alto rendimento. O protocolo descreve os métodos para avaliação quantitativa das espécies reativas de oxigênio (EROs) intracelulares nas três diferentes linhagens celulares de carcinoma hepatocelular.

Abstract

As espécies reativas de oxigênio (EROs) desempenham um papel fundamental na regulação do metabolismo celular em processos fisiológicos e patológicos. A produção fisiológica de ERO desempenha um papel central na modulação espacial e temporal de funções celulares normais, como proliferação, sinalização, apoptose e senescência. Em contraste, a superprodução crônica de ERO é responsável por um amplo espectro de doenças, como câncer, doenças cardiovasculares e diabetes, entre outras. Quantificar os níveis de ROS de forma precisa e reprodutível é, portanto, essencial para entender a funcionalidade celular normal. Métodos baseados em imagens de fluorescência para caracterizar espécies intracelulares de ROS é uma abordagem comum. Muitos dos protocolos de imagem ROS na literatura utilizam o corante diacetato de 2′-7′-diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA). No entanto, este corante sofre de limitações significativas em seu uso e interpretabilidade. O protocolo atual demonstra o uso de uma sonda fluorescente de diidroetídio (DHE) como um método alternativo para quantificar a produção total de ROS em um ambiente de alto rendimento. A plataforma de geração de imagens de alto rendimento, CX7 Cellomics, foi usada para medir e quantificar a produção de ROS. Este estudo foi realizado em três linhagens de células de câncer hepatocelular – HepG2, JHH4 e HUH-7. Este protocolo fornece uma descrição detalhada dos vários procedimentos envolvidos na avaliação de ROS dentro das células, incluindo – preparação de solução de DHE, incubação de células com solução de DHE e medição da intensidade de DHE necessária para caracterizar a produção de ROS. Este protocolo demonstra que o corante fluorescente DHE é uma escolha robusta e reprodutível para caracterizar a produção intracelular de ROS de forma de alto rendimento. Abordagens de alto rendimento para medir a produção de ROS provavelmente serão úteis em uma variedade de estudos, como toxicologia, rastreamento de drogas e biologia do câncer.

Introduction

Espécies reativas de oxigênio (ROS) são um grupo de radicais químicos de ocorrência natural, altamente reativos e temporalmente instáveis formados como parte do metabolismo celular normal nas células. As ERO desempenham um papel fundamental e essencial na modulação dos processos fisiológicos e bioquímicos normais que ocorrem nas células ^1,2. A principal fonte de produção de ERO nas células é a via da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial (ETC) como parte do ciclo bioenergético normal. Fontes adicionais significativas de produção de ROS incluem reações enzimáticas como NADPH oxidases celulares em células. O metabolismo das moléculas alimentares (por exemplo, glicose) ocorre através da via de fosforilação oxidativa na matriz mitocondrial. Um nível basal de produção de ERO é essencial para regular os processos normais de sinalização celular fisiológica. Muitas moléculas de proteínas-chave que fazem parte das vias de sinalização metabólica da glicose (por exemplo, Akt e PTEN) são conhecidas por responder aos níveis intracelulares de ROS. Além disso, as ERO são produzidas por várias enzimas intracelulares, como xantina oxidase, óxido nítrico sintase e constituintes peroxissomais, como parte das vias enzimáticas celulares ^1,2. Em contraste com as fontes naturais de EROs, certos fatores ambientais, como xenobióticos, agentes infecciosos, luz UV, poluição, tabagismo e radiação, também levam à produção excessiva de EROs, que são um dos principais impulsionadores do estresse oxidativo intracelular ^1,3. O estresse oxidativo celular elevado pode causar danos às biomoléculas nativas no interior de uma célula, como lipídios, proteínas e DNA, causando várias doenças como câncer, diabetes, doenças cardiovasculares, inflamação crônica e doenças neurodegenerativas ^1,3,4. Portanto, medidas precisas de ERO são essenciais para entender os mecanismos celulares envolvidos na fisiopatologia da doença induzida pelo estresse oxidativo.

Devido às curtas escalas de tempo de produção e eliminação de ROS dentro das células, medidas quantitativas de vários radicais ROS permanecem um desafio. Métodos como ressonância paramagnética eletrônica (RPE)⁵, cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) e imagens baseadas em sonda de fluorescência são usados para medir as várias ROS celulares⁶. Enquanto métodos como EPR e HPLC produzem estimativas quantitativamente precisas, esses métodos envolvem a destruição da morfologia espacial celular e geralmente estão na forma de medidas globais e em massa de uma amostra. Em contraste, métodos baseados em imagem, como métodos baseados em sonda de fluorescência, mantêm a morfologia celular e o contexto espacial da geração de EROs. No entanto, a especificidade de várias sondas de fluorescência para diferentes tipos de radicais ROS não está bem estabelecida ^7,8. Várias sondas fluorescentes como diidroetídio (DHE), diacetato de diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA), diidrorodamina (DHR), dimetilantraceno (DMA), 2,7 diclorodihidrofluresceína (DCFH), 1,3-Difenilisobenzofurano (DPBF) e MitoSox estão disponíveis para detecção de ROS comercialmente. Nas últimas décadas, DHE, MitoSox e DCFH-DA são os corantes fluorescentes comumente utilizados para medir ERO em células e tecidos ^8,9. DCFH-DA é um corante amplamente utilizado para detectar H₂O₂ intracelular e estresse oxidativo. Apesar da popularidade da DCFH-DA, vários estudos prévios mostraram que ela não pode ser usada de forma confiável para medir os níveis intracelulares de H₂O₂ e outras ROS 8,9,10,11,12,13,14.

Em contraste, a sonda fluorescente diidroetídio (DHE) apresenta uma resposta específica ao radical superóxido intracelular (O₂^–). Embora o radical superóxido seja uma das muitas espécies de ROS observadas nas células, é um importante radical envolvido na redução de metais de transição, conversão em peroxinitrato e formação de hidroperóxidos, entre outros efeitos intracelulares. O DHE é rapidamente absorvido pelas células e tem uma emissão de fluorescência na faixa de comprimento de onda vermelha¹⁵. Após a reação com o radical superóxido especificamente, o DHE forma um produto fluorescente vermelho, 2-hidroxietídio (2-OH-E⁺). Assim, o DHE pode ser considerado como uma sonda específica para detecção de superóxido. No entanto, DHE também pode sofrer oxidação inespecífica com ^{ONOO- ou OH.}, H₂O_2, e citocromo c para formar um segundo produto de fluorescência, etídio E^+, que pode interferir com os níveis medidos de 2-OH-E⁺. No entanto, esses produtos 2-OH E⁺ e E⁺, em combinação, representam a maior parte do total de espécies celulares de ROS observadas dentro de uma célula quando coradas com DHE. O E⁺ intercala no DNA, aumentando sobremaneira sua fluorescência ^{8,9,10,11,13,14,15,16}. Uma vez que os espectros de fluorescência do etídio e do 2-hidroxietídio diferem apenas ligeiramente, a maioria dos níveis de ROS observados em uma célula secundária à produção de superóxido pode ser detectada e medida usando produtos de fluorescência DHE. Essas espécies de ROS são identificadas usando excitação de comprimento de onda de 480 nm e emissão de comprimento de onda de 610 nm 15,16,17.

Além de escolher uma sonda de detecção de ROS fluorescente específica, é importante escolher um método sensível de detecção para medir ROS intracelular. A avaliação precisa dos níveis intracelulares de ROS é, portanto, fundamental para identificar estados de equilíbrio redox perturbados que ocorrem em células doentes ou que foram expostas a vários estressores ambientais, como radiação, compostos toxicológicos e agentes genotóxicos¹⁸. Uma vez que as ROS são um fenômeno comum em células que é responsável por regular uma variedade de atividades de sinalização celular, métodos robustos de detecção de ROS são essenciais. Para permitir essa avaliação de alto rendimento da produção de ROS dentro das células, este protocolo usa uma plataforma de triagem de alto conteúdo (HCS) para medir as espécies de ROS. O protocolo atual permite a análise em alto rendimento da produção intracelular de EROs, o que é de fundamental importância em muitos estudos toxicológicos¹⁹. Este protocolo visa fornecer uma solução fácil e versátil para detectar e medir ERO intracelular em células de carcinoma hepatocelular aderente. Os reagentes químicos de H₂O₂ e menadione são usados como potentes estimuladores de ROS para medir os níveis relativos de produção de ROS em um ambiente controlado e de alto rendimento. Este protocolo pode ser ajustado para medir a produção de ERO em células aderentes e não aderentes em condições apropriadas, conforme necessário.

Protocol

1. Cultura celular Semeando as células teste (células de carcinoma hepatocelular HepG2, HUH7 e JHH4) em uma placa de 96 poços a uma densidade de semeadura de 10.000 células/poço em um volume final de semeadura de 200 μL por poço.Antes de cultivar as células HepG2, revestir os 96 poços de placa com colágeno tipo IV (50 μg/mL) por 2 h de duração à temperatura ambiente (TR). Para evitar a solidificação do colágeno estoque, coloque a solução estoque em gelo e, posteriorme…

Representative Results

Diidroetídio (DHE) é um corante de fluorescência responsivo a superóxidos que fornece informações específicas sobre os estados de ROS intracelulares. O corante DHE emite intrinsecamente fluorescência azul no citoplasma. Entretanto, ao interagir com radicais superóxido, é transformado em 2-hidroxietídio, que emite fluorescência nos comprimentos de onda vermelho (>550 nm) (Figura 1). O corante DHE é facilmente transportado para as células e o núcleo. A fluorescência emitida pod…

Discussion

Neste estudo, um protocolo para avaliar a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) intracelulares impulsionadas por superóxido usando corante de fluorescência diidroetídio (DHE) foi estabelecido em um sistema de triagem de alto conteúdo. A maioria dos protocolos atuais disponíveis na literatura utiliza a DCFH-DA como sonda de imagem de fluorescência para quantificar espécies de ROS. No entanto, vários estudos têm demonstrado que a DCFH-AD não é uma sonda ideal para a mensuração de ERO intracelula…

Materials

1.5 mL centrifuge tubes	VWR	20170-038
96- well plate	Corning Costar	07-200-90
Cellomics Cx7	ThermoFisher	HCSDCX7LEDPRO
Collagen	Advanced Biomatrix	5056
DHE (Dihydroethidium)	ThermoFisher	D1168
DMEM	Sigma	6046
FBS	VWR	97068-085
GraphPad Prism	GraphPad	Version 6.0
HepG2 cell line	ATCC
Hoechst	ThermoFisher	33342
HUH7 cell line	ATCC
Hydrogen Peroxide	Sigma	88597
JHH4 cell line	ATCC
Menadione	Sigma	M5625