हाइड्रोपोनिक स्थिति में Arabidopsis thaliana जड़ों पर बैक्टीरियल उपनिवेशण को मापना
Summary
राइजोस्फीयर में पौधे की वृद्धि को बढ़ावा देने वाले राइजोबैक्टीरिया (PGPR) का उपनिवेशण इसके विकास को बढ़ावा देने वाले प्रभाव के लिए आवश्यक है। बैक्टीरियल राइजोस्फीयर उपनिवेशण का पता लगाने की विधि को मानकीकृत करना आवश्यक है। यहां, हम जड़ की सतह पर बैक्टीरिया के उपनिवेशण की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि का वर्णन करते हैं।
Abstract
Arabidopsis thaliana जड़ पर बैक्टीरियल उपनिवेशण को मापना पौधे-सूक्ष्म जीव बातचीत के अध्ययन में सबसे लगातार प्रयोगों में से एक है। प्रजनन क्षमता में सुधार के लिए राइजोस्फीयर में बैक्टीरियल उपनिवेशण को मापने के लिए एक मानकीकृत विधि आवश्यक है। हमने पहले हाइड्रोपोनिक स्थितियों में बाँझ A.thaliana को सुसंस्कृत किया और फिर 0.01 के OD600 की अंतिम एकाग्रता में राइजोस्फीयर में बैक्टीरिया कोशिकाओं को टीका लगाया। टीकाकरण के बाद 2 दिनों में, जड़ ऊतक काटा गया था और बाँझ पानी में तीन बार धोया गया था ताकि अनकोलोनाइज्ड बैक्टीरिया कोशिकाओं को हटाया जा सके। जड़ों को तब तौला गया था, और जड़ पर उपनिवेशित बैक्टीरिया कोशिकाओं को भंवर द्वारा एकत्र किया गया था। सेल निलंबन एक फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) बफर के साथ एक ढाल में पतला था, इसके बाद एक लुरिया-बर्टानी (एलबी) अगर माध्यम पर चढ़ाना था। प्लेटों को 10 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया था, और फिर, एलबी प्लेटों पर एकल कालोनियों को गिना गया और जड़ों पर उपनिवेशित बैक्टीरिया कोशिकाओं को इंगित करने के लिए सामान्यीकृत किया गया। इस विधि का उपयोग मोनो-इंटरैक्शन स्थितियों में राइजोस्फीयर में बैक्टीरिया के उपनिवेशण का पता लगाने के लिए किया जाता है, जिसमें अच्छी प्रजनन क्षमता होती है।
Introduction
एकल जीवाणु तनाव द्वारा राइजोस्फीयर उपनिवेशण का पता लगाने के लिए मात्रात्मक और गुणात्मक तरीके हैं। गुणात्मक विधि के लिए, एक तनाव है कि संवैधानिक प्रतिदीप्ति व्यक्त इस्तेमाल किया जाना चाहिए, और प्रतिदीप्ति वितरण और तीव्रता प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी या लेजर फोकल उपकरणों 1,2 के तहत जांच की जानी चाहिए. उन रणनीतियों अच्छी तरह से स्वस्थानी3 में बैक्टीरियल उपनिवेशण को प्रतिबिंबित कर सकते हैं, लेकिन वे मात्रा का ठहराव में पारंपरिक प्लेट गिनती के तरीकों के रूप में के रूप में सटीक नहीं हैं. इसके अलावा, माइक्रोस्कोप के तहत केवल आंशिक रूट ज़ोन प्रदर्शित करने की सीमा के कारण, कभी-कभी यह व्यक्तिपरक पूर्वाग्रह से प्रभावित हो सकता है।
यहां, हम एक मात्रात्मक विधि का वर्णन करते हैं, जिसमें उपनिवेशित जीवाणु कोशिकाओं को इकट्ठा करना और एक प्लेट पर बैक्टीरिया सीएफयू की गिनती करना शामिल है। यह विधि कमजोर पड़ने और चढ़ाना पर आधारित है जिसके द्वारा पौधों की जड़ों से छीन लिए गए उपनिवेशित उपभेदों को गिना जा सकता है, और जड़ पर कुल उपनिवेशित बैक्टीरिया संख्या की गणना 4,5 की जा सकती है।
सबसे पहले, ए थालियाना को हाइड्रोपोनिक स्थितियों में सुसंस्कृत किया गया था, और फिर जीवाणु कोशिकाओं को 0.01 आयुध डिपो600 की अंतिम एकाग्रता में राइजोस्फीयर में टीका लगाया गया था। संक्रमित जड़ के ऊतकों को टीकाकरण के 2 दिन बाद काटा गया और बिना उपनिवेशित जीवाणु कोशिकाओं को हटाने के लिए बाँझ पानी में धोया गया। इसके अलावा, जड़ पर उपनिवेशित जीवाणु कोशिकाओं को एकत्र किया गया, फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) बफर में पतला किया गया, और एक लुरिया-बर्टानी (एलबी) अगर माध्यम पर चढ़ाया गया। 10 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन के बाद, एलबी प्लेटों पर एकल कालोनियों को गिना गया और जड़ों पर उपनिवेशित बैक्टीरिया कोशिकाओं को निर्धारित करने के लिए सामान्यीकृत किया गया।
यह विधि अत्यधिक लागू है, इसमें अच्छी पुनरावृत्ति है, और सटीक राइजोस्फीयर बैक्टीरियल उपनिवेशण निर्धारण के लिए अधिक उपयुक्त है।
Protocol
Representative Results
Discussion
अच्छा प्रजनन क्षमता प्राप्त करने के लिए, इस प्रोटोकॉल के उपनिवेशण का पता लगाने की प्रक्रिया के लिए चार महत्वपूर्ण कदम हैं। सबसे पहले, यह सुनिश्चित करना आवश्यक है कि टीका बैक्टीरिया कोशिकाओं की संख्या …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (32370135), चाइनीज एकेडमी ऑफ एग्रीकल्चरल साइंसेज (CAAS-CSAL-202302) के इनोवेशन प्रोग्राम, जिआंगसु वोकेशनल कॉलेज ऑफ एग्रीकल्चर एंड फॉरेस्ट्री (2021kj29) के विज्ञान और प्रौद्योगिकी परियोजना द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Filter cell stainer | Solarbio | F8200-40µm | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Murashige and Skoog medium | Hopebio | HB8469-5 | |
| NaClO | Alfa | L14709 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Square petri dish | Ruiai Zhengte | PYM-130 | |
| Vortex Genie2 | Scientific Industries | G560E |
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