水耕栽培状態における シロイヌナズ ナの根の細菌コロニー形成の測定
Summary
根圏における植物成長促進根圏細菌(PGPR)のコロニー形成は、その成長促進効果に不可欠です。細菌の根圏コロニー形成の検出方法を標準化する必要があります。ここでは、根の表面での細菌のコロニー形成を定量化するための再現性のある方法について説明します。
Abstract
シロイヌナズナの根の細菌のコロニー形成を測定することは、植物と微生物の相互作用研究において最も頻繁な実験の1つです。根圏における細菌のコロニー形成を測定するための標準化された方法は、再現性を向上させるために必要です。まず、無菌のA.thalianaを水耕栽培状態で培養し、根圏の細菌細胞を最終濃度OD60000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000接種後2日目に、根組織を採取し、滅菌水で3回洗浄して、コロニーを形成していない細菌細胞を除去しました。次に、根の重量を量り、根にコロニーを形成した細菌細胞を渦によって収集しました。細胞懸濁液をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)緩衝液でグラジエントで希釈した後、Luria-Bertani(LB)寒天培地にプレーティングしました。プレートを37°Cで10時間インキュベートした後、LBプレート上の単一コロニーをカウントし、根にコロニーを形成した細菌細胞を示すために正規化しました。この方法は、単相互作用条件で根圏内の細菌のコロニー形成を良好な再現性で検出するために使用されます。
Introduction
単一の細菌株による根圏のコロニー形成を検出するための定量的および定性的な方法があります。定性的方法には、蛍光を構成的に発現する株を使用し、蛍光分布と強度を蛍光顕微鏡またはレーザー共焦点装置1,2で調べる必要があります。これらの戦略は、in situ3 で細菌のコロニー形成をよく反映できますが、定量化における従来のプレート計数方法ほど正確ではありません。また、顕微鏡下では部分的な根域しか表示できないという制限があるため、主観的な偏見の影響を受けることがあります。
ここでは、コロニーを形成した細菌細胞を収集し、プレート上の細菌CFUをカウントすることを含む定量的方法について説明します。この方法は、植物の根から取り除かれたコロニー化された株を数えることができ、根上のコロニー化された細菌の総数を計算することができる希釈とプレーティングに基づいています4,5。
まず、 A. thaliana を水耕栽培条件で培養し、次いで細菌細胞を根圏に最終濃度0.01OD600で接種した。感染した根組織は、接種後2日で採取され、滅菌水で洗浄されて、コロニー化されていない細菌細胞を除去した。さらに、根にコロニーを形成した細菌細胞を採取し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)緩衝液で希釈し、Luria-Bertani(LB)寒天培地に播種しました。37°Cで10時間インキュベートした後、LBプレート上の単一コロニーをカウントして標準化し、根にコロニーを形成した細菌細胞を決定しました。
この方法は、適用性が高く、再現性が高く、根圏細菌のコロニー形成を正確に測定するのに適しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
良好な再現性を達成するために、このプロトコルのコロニー形成検出プロセスには4つの重要なステップがあります。まず、各実験で接種した細菌細胞の数がまったく同じになるようにする必要があります。第二に、コロニー化されていない細菌の洗浄強度を滅菌水で制御することも必要です。第三に、マイクロ遠心チューブに沈みやすいバクテリアの特性による吸収誤差を避けるために、サ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家自然科学基金会(32370135)、中国農業科学院のイノベーションプログラム(CAAS-CSAL-202302)、江蘇省農林職業学院科学技術プロジェクト(2021kj29)から資金提供を受けました。
Materials
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Filter cell stainer | Solarbio | F8200-40µm | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Murashige and Skoog medium | Hopebio | HB8469-5 | |
| NaClO | Alfa | L14709 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Square petri dish | Ruiai Zhengte | PYM-130 | |
| Vortex Genie2 | Scientific Industries | G560E |
Riferimenti
- Wang, B., Wan, C., Zeng, H. Colonization on cotton plants with a GFP labeled strain of Bacillus axarquiensis. Curr Microbiol. 77 (10), 3085-3094 (2020).
- Zhai, Z., et al. A genetic tool for production of GFP-expressing Rhodopseudomonaspalustris for visualization of bacterial colonization. AMB Express. 9 (1), 141 (2019).
- Synek, L., Rawat, A., L’Haridon, F., Weisskopf, L., Saad, M. M., Hirt, H. Multiple strategies of plant colonization by beneficial endophytic Enterobacter sp. SA187. Environ Microbiol. 23 (10), 6223-6240 (2021).
- Zhang, H., et al. Bacillus velezensis tolerance to the induced oxidative stress in root colonization contributed by the two-component regulatory system sensor ResE. Plant Cell Environ. 44 (9), 3094-3102 (2021).
- Liu, Y., et al. Plant commensal type VII secretion system causes iron leakage from roots to promote colonization. Nat Microbiol. 8 (8), 1434-1449 (2023).
- Feng, H., et al. Identification of chemotaxis compounds in root exudates and their sensing chemoreceptors in plant-growth-promoting Rhizobacteria Bacillus amyloliquefaciens SQR9. Mol Plant Microbe Interact. 31, 995-1005 (2018).
- Woo, S. L., Hermosa, R., Lorito, M., Monte, E. Trichoderma: a multipurpose, plant-beneficial microorganism for eco-sustainable agriculture. Nat Rev Microbiol. 21 (5), 312-326 (2023).
- Nongkhlaw, F. M., Joshi, S. R. Microscopic study on colonization and antimicrobial property of endophytic bacteria associated with ethnomedicinal plants of Meghalaya. J Microsc Ultrastruct. 5 (3), 132-139 (2017).
- Ravelo-Ortega, G., Raya-González, J., López-Bucio, J. Compounds from rhizosphere microbes that promote plant growth. Curr Opin Plant Biol. 73, 1369-5266 (2023).
- Schulz-Bohm, K., Gerards, S., Hundscheid, M., Melenhorst, J., de Boer, W., Garbeva, P. Calling from distance: attraction of soil bacteria by plant root volatiles. ISME J. 12 (5), 1252-1262 (2018).
- Sharifi, R., Lee, S. M., Ryu, C. M. Microbe-induced plant volatiles. New Phytol. 220 (3), 684-691 (2018).
- Eckshtain-Levi, N., Harris, S. L., Roscios, R. Q., Shank, E. A. Bacterial community members increase Bacillus subtilis maintenance on the roots of Arabidopsis thaliana. Phytobiomes J. 4, 303-313 (2020).
- Liu, Y., et al. Root colonization by beneficial rhizobacteria. FEMS Microbiol Rev. 48, (2024).
- Yahya, M., et al. Differential root exudation and architecture for improved growth of wheat mediated by phosphate solubilizing bacteria. Front Microbiol. 12, 744094 (2021).
- Husna, K. B. -. E., Won, M. -. H., Jeong, M. -. I., Oh, K. -. K., Park, D. S. Characterization and genomic insight of surfactin-producing Bacillus velezensis and its biocontrol potential against pathogenic contamination in lettuce hydroponics. Environ Sci Pollut Res Int. 30 (58), 121487-121500 (2023).
