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Biologia

वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन प्रतिक्रिया-आधारित पहचान और हेपेटाइटिस बी वायरस डीएनए की मात्रा का ठहराव

Published: December 15, 2023
doi:
10.3791/66249
, , , , ,
13B BlackBio Biotech India Limited

Summary

वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) आधारित पता लगाने और हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी) डीएनए की मात्रा का ठहराव एचबीवी संक्रमण के निदान और निगरानी के लिए एक संवेदनशील और सटीक तरीका है। यहां, हम एचबीवी डीएनए का पता लगाने और एक नमूने के वायरल लोड माप के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी) दुनिया भर में यकृत रोग का एक महत्वपूर्ण कारण है। यह तीव्र या पुराने संक्रमण का कारण बन सकता है, जिससे व्यक्ति घातक सिरोसिस और यकृत कैंसर के लिए अतिसंवेदनशील हो जाते हैं। एचबीवी संक्रमण के निदान और निगरानी के लिए रक्त में एचबीवी डीएनए का सटीक पता लगाना और मात्रा का ठहराव आवश्यक है। एचबीवी डीएनए का पता लगाने का सबसे आम तरीका रीयल-टाइम पीसीआर है, जिसका उपयोग वायरस का पता लगाने और एंटीवायरल थेरेपी की प्रतिक्रिया की निगरानी के लिए वायरल लोड का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। यहां, हम आईवीडी-चिह्नित रीयल-टाइम पीसीआर-आधारित किट का उपयोग करके मानव सीरम या प्लाज्मा में एचबीवी डीएनए का पता लगाने और मात्रा का ठहराव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। किट प्राइमरों और जांच का उपयोग करता है जो एचबीवी जीनोम के अत्यधिक संरक्षित कोर क्षेत्र को लक्षित करते हैं और सभी एचबीवी जीनोटाइप (ए, बी, सी, डी, ई, एफ, जी, एच, आई और जे) को सटीक रूप से निर्धारित कर सकते हैं। किट में संभावित पीसीआर निषेध की निगरानी के लिए एक अंतर्जात आंतरिक नियंत्रण भी शामिल है। यह परख 40 चक्रों के लिए चलता है, और इसका कटऑफ 38 सीटी है। नैदानिक नमूनों में एचबीवी डीएनए की मात्रा का ठहराव के लिए, किट के साथ 5 परिमाणीकरण मानकों का एक सेट प्रदान किया जाता है। मानकों में एचबीवी-विशिष्ट डीएनए की ज्ञात सांद्रता होती है जो न्यूक्लिक एसिड परीक्षण (एनआईबीएससी कोड 10/266) के लिए एचबीवी डीएनए के लिए 4वें डब्ल्यूएचओ अंतर्राष्ट्रीय मानक के खिलाफ कैलिब्रेट की जाती है। मानकों का उपयोग एचबीवी-विशिष्ट डीएनए प्रवर्धन की कार्यक्षमता को मान्य करने और एक मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए किया जाता है, जिससे एक नमूने में एचबीवी डीएनए की मात्रा का ठहराव हो सकता है। पीसीआर किट का उपयोग करके एचबीवी डीएनए का 2.5 आईयू / एमएल के रूप में कम पता लगाया गया था। किट की उच्च संवेदनशीलता और प्रजनन क्षमता इसे नैदानिक प्रयोगशालाओं में एक शक्तिशाली उपकरण बनाती है, जो एचबीवी संक्रमणों के प्रभावी निदान और प्रबंधन में स्वास्थ्य पेशेवरों की सहायता करती है।

Introduction

हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी) जीनस ऑर्थोहेपडनावायरस और हेपडनविरिडे परिवार1 से आंशिक रूप से डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए वायरस है। यह एक पुराने संक्रमण को ट्रिगर कर सकता है जो जीवन भर बना रहता है, संभावित रूप से यकृत सिरोसिस और हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा 2,3,4 का कारण बनता है। विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) के अनुसार, 2019 में 296 मिलियन लोगों की अनुमानित आबादी क्रोनिक हेपेटाइटिस बी संक्रमण के साथ रह रही थी, और हर साल5 मिलियन लोग नए संक्रमित थे।

सीरम या प्लाज्मा नमूनों में एचबीवी डीएनए की पहचान और माप चल रहे हेपेटाइटिस बी संक्रमण वाले व्यक्तियों का पता लगाने, एंटीवायरल उपचार की प्रभावकारिता का आकलन करने और उपचार की सफलता की संभावना की भविष्यवाणी करने के लिए एक मूल्यवान विधि के रूप में कार्य करता है 6,7,8,9,10,11. उच्च वायरल लोड सिरोसिस और जिगर कैंसर12,13 सहित जिगर रोग की प्रगति का एक बढ़ा जोखिम के साथ जुड़ा हुआ है. इसलिए, एचबीवी संक्रमण की प्रगति पर नज़र रखने और उपचार के बारे में निर्णयों को सूचित करने के लिए वायरल लोड का सटीक माप महत्वपूर्ण है।

मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर assays उच्च संवेदनशीलता, व्यापक गतिशील रेंज, और पारंपरिक पीसीआर तकनीक 14,15,16,17 की तुलना में एचबीवी डीएनए की अधिक सटीक मात्रा का ठहराव है. सीरम या प्लाज्मा नमूनों में एचबीवी डीएनए की मात्रा के लिए कई वाणिज्यिक वास्तविक समय पीसीआर-आधारित आणविक नैदानिक किट बाजार में उपलब्ध हैं। यहां, हम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, आईवीडी-चिह्नित रीयल-टाइम पीसीआर-आधारित किट का उपयोग करके मानव सीरम या प्लाज्मा में एचबीवी डीएनए का पता लगाने और मात्रा का ठहराव के लिए एक विस्तृत वर्कफ़्लो का वर्णन करते हैं। किट एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया 18,19, कम लागत, अभी तक अत्यधिक संवेदनशील परख है, और इसकी प्रदर्शन विशेषताओं अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सीई चिह्नित किट (ओं)18के साथ तुलनीय हैं. एचबीवी लक्ष्य क्षेत्र प्रवर्धन के अलावा, नमूनों की गुणवत्ता, निकाले गए डीएनए की गुणवत्ता, पीसीआर प्रवर्धन और संभावित पीसीआर निषेध को सत्यापित करने के लिए किट में एक अंतर्जात आंतरिक नियंत्रण जीन भी शामिल है।

Protocol

इस अध्ययन में कोई मानव प्रतिभागी या नैदानिक नमूने शामिल नहीं थे। उपयोग की जाने वाली एकमात्र जैविक सामग्री न्यूक्लिक एसिड परीक्षण (एनआईबीएससी कोड 10/266) के लिए एचबीवी डीएनए के लिए 4वें डब्ल्यूएचओ अंत?…

Representative Results

मानव प्लाज्मा/सीरम से एचबीवी डीएनए का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए वर्कफ़्लो का एक योजनाबद्ध आरेख चित्र 1में दिखाया गया है। एचबीवी और आईसी दोनों के लिए मानक 2 (पीसी के रूप में प्र…

Discussion

एनआईबीएससी कोड 10/266 को 9,55,000 आईयू/एमएल की एक इकाई सौंपी गई है जब आपूर्तिकर्ताकी जानकारी के अनुसार न्यूक्लीज-मुक्त पानी के 0.5 एमएल में पुनर्गठन किया गया है। इसे एक उच्च-लोड एचबीवी पॉजिटिव नमूना मान?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

हम प्रवीण, कुसुम, चंदन, ईशा, रश्मि, बबली, शिवानी, अंकिता और शिखा को उनकी तकनीकी सहायता के लिए स्वीकार करते हैं।

Materials

4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNA NIBSC NIBSC code: 10/266 The 4th WHO International Standard for hepatitis B virus (HBV) DNA, NIBSC code 10/266, is intended to be used for the calibration of secondary reference reagents used in HBV nucleic acid amplification techniques (NAT).
ABI real-time PCR machines  ThermoFisher Scientific ABI 7500; QuantStudio 5 This is a real time PCR machine 
HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198 NIBSC NIBSC code: 14/198 This is a very low positive triplex reagent for NAT assays containing hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1)
QIAGEN real-time PCR machine Qiagen Rotor-Gene Q This is a real time PCR machine 
TRUPCR HBV Viral Load kit  Kilpest India Limited 3B294 This is a real time PCR based kit used in this study for the HBV DNA detection and viral load determination
TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction Kit Kilpest India Limited 3B214 This is a DNA extraction kit used for the extraction of HBV viral DNA from NIBSC:10/266 and NIBSC:14/198
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Bag, S., Ghosh, S., Lalwani, R., Vishnoi, P., Gupta, S., Dubey, D. Real-Time Polymerase Chain Reaction-Based Detection and Quantification of Hepatitis B Virus DNA. J. Vis. Exp. (202), e66249, doi:10.3791/66249 (2023).
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