Summary
Die Manipulation der RNA-Interferenz (RNAi) stellt bei vielen parasitoiden Arten mit geringer Größe, wie z. B. Trichogramma-Wespen , eine gewaltige Herausforderung dar. Diese Studie beschrieb eine effiziente RNAi-Methode in Trichogramma denrolimi. Die vorliegende Methodik bietet ein robustes Modell für die Untersuchung der Genregulation bei Trichogramma-Wespen .
Abstract
Die Eiparasitoide, Trichogramma spp., sind als wirksame biologische Schädlingsbekämpfungsmittel gegen verschiedene Schmetterlingsschädlinge in Land- und Forstwirtschaft anerkannt. Die unreifen Stadien der Trichogramma-Nachkommen entwickeln sich innerhalb des Wirteis und weisen eine bemerkenswerte Winzigkeit auf (ca. 0,5 mm in der adulten Länge). Die RNA-Interferenz-Methode (RNAi) hat sich als entscheidendes Werkzeug zur Aufklärung von Genfunktionen in zahlreichen Organismen herausgestellt. Die Manipulation von RNAi in bestimmten kleinen parasitoiden Arten wie Trichogramma hat jedoch im Allgemeinen erhebliche Herausforderungen mit sich gebracht. In dieser Studie stellen wir eine effiziente RNAi-Methode in Trichogramma denrolimi vor. Das skizzierte Verfahren umfasst die Gewinnung und Isolierung einzelner T. dendrolimi-Proben aus Wirtseiern, das Design und die Synthese von doppelsträngiger RNA (dsRNA), die In-vitro-Transplantation und Kultivierung von T. dendrolimi-Puppen , die Mikroinjektion von dsRNA und die anschließende Beurteilung des Zielgen-Knockdowns durch RT-qPCR-Analyse. Diese Studie liefert ein umfassendes, visuell detailliertes Verfahren zur Durchführung von RNAi-Experimenten in T. dendrolimi und ermöglicht es den Forschern, die Genregulation in dieser Art zu untersuchen. Darüber hinaus ist diese Methodik mit geringfügigen Anpassungen für RNAi-Studien oder Mikroinjektionen in anderen Trichogramma-Arten anpassbar, was sie zu einer wertvollen Referenz für die Durchführung von RNAi-Experimenten an anderen endoparasitären Arten macht.
Introduction
Trichogramma spp. sind eine Gruppe von Eiparasitoiden, die als hocheffiziente biologische Bekämpfungsmittel gegen ein breites Spektrum von Lepidoptera-Schädlingen in land- und forstwirtschaftlichen Ökosystemen weltweit eingesetzt wurden 1,2,3,4. Die Anwendung von Trichogramma aus Massenzucht bietet einen umweltfreundlichen Ansatz für die nachhaltige Bekämpfung von Schädlingen 5,6,7. Das Verständnis der Molekularbiologie von Trichogramma-Wespen liefert wertvolle Einblicke in die Verbesserung der Massenaufzuchteffizienz und der Feldleistung dieser biologischen Bekämpfungsmittel 8,9 durch die Untersuchung der Methodik der Genregulation und Genom-Editierung10.
Seit der Entdeckung der doppelsträngigen RNA (dsRNA)-vermittelten spezifischen genetischen Interferenz in Caenorhabditis elegans im Jahr 1998 hat sich die RNA-Interferenzmethode (RNAi) zu einem wichtigen genetischen Instrumentarium zur Erforschung der Regulationsmechanismen von Organismen entwickelt, indem sie die Expression von Zielgenen unterdrückt11. RNAi-Experimente sind zu einer Standardmethode geworden, die häufig zur Untersuchung der Genfunktion bei zahlreichen Insektenarten eingesetzt wird12,13. Nichtsdestotrotz stellt die Manipulation von RNAi bei vielen parasitoiden Arten eine gewaltige Herausforderung dar, insbesondere bei denen, die zur Familie der endoparasitären Chalkidoiden gehören 14,15,16. Die RNAi-Methode wurde bei mindestens 13 parasitoiden Spezies dokumentiert: 14,15,16,17,18,19. Unter diesen wurde der RNAi-Ansatz umfassend bei Nasonia-Wespen durchgeführt und ist in allen Entwicklungsstadien anwendbar, einschließlich Embryonen, Larven, Puppen und Erwachsenen 14,15,16. Es ist bemerkenswert, dass Nasonia-Wespen Ektoparasitoide sind, deren Nachkommen sich im Zwischenraum zwischen der Wirtspupa und dem Puparium entwickeln, was ihre Kultivierung in vitro ermöglicht und sie bestimmte Behandlungen wie Mikroinjektionen tolerieren lässt. Im Gegensatz zu Nasonia-Wespen durchlaufen Trichogramma-Individuen ihre gesamte Embryonal-, Larven- und Puppenentwicklung innerhalb des Wirteies. Die Schicht im Embryo- und Larvenstadium (die die dsRNA-Permeabilität beeinträchtigen kann), die Anfälligkeit für Schäden und die Schwierigkeit, in vitro zu überleben, stellen gewaltige Hindernisse dar 20,21,22. Darüber hinaus macht die geringe Größe von Trichogramma-Individuen, etwa ~0,5 mm in der Erwachsenen- oder Puppenlänge, sie äußerst kompliziert, um sie zu manipulieren 20,21,22.
In der vorliegenden Studie skizzieren wir ein umfassendes Verfahren zur Durchführung von RNA-Interferenz-Experimenten (RNAi) in Trichogramma denrolimi Matsumura. Dieses Verfahren umfasst die folgenden Verfahren: (1) das Design und die Synthese von doppelsträngiger RNA (dsRNA), (2) die Mikroinjektion von T. denrolimi-Puppen, (3) die Transplantation und Inkubation dieser Puppen und (4) den Nachweis des Zielgen-Knockdowns durch RT-qPCR-Analyse. Das für das RNAi-Experiment ausgewählte Zielgen ist die Ferritin-Schwerketten-Homologie (Ferhch). FerHCH, ein eisenbindendes Protein, enthält ein Ferroxidase-Zentrum, das mit antioxidativen Fähigkeiten ausgestattet ist und die Oxidation von Fe2+ zu Fe3+ erleichtert. Es spielt eine unverzichtbare Rolle beim Wachstum und der Entwicklung verschiedener Organismen, indem es das Redoxgleichgewicht und die Eisenhomöostase aufrechterhält. Die Erschöpfung von FerHCH kann zu einer Überakkumulation von Eisen führen, was zu irreversiblen Gewebeschäden führt und oft zu signifikanten phänotypischen Veränderungen führt, einschließlich Wachstumsdefekten, Deformitäten und Mortalität23,24. Diese Studie bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Durchführung von RNAi in T. denrolimi, die für die Untersuchung der Genfunktionen im breiteren Kontext von Trichogramma-Wespen von unschätzbarem Wert sein wird.
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Protocol
HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Instrumenten, Software und Reagenzien, die in diesem Protokoll verwendet werden.
1. Sammlung und Pflege von Insektenkulturen
- Kleben Sie eine Gruppe von ~5.000 Eiern Corcyra cephalonica (Stainton) auf eine 9 cm x 16 cm große Karte mit einer 1:5 (v/v) Lösung aus Gummi arabicum-Pulver und Wasser25,26.
HINWEIS: Vermeiden Sie es, zu viele Wirtseier an der Karte anzubringen, da die Überfüllung sie für nachfolgende Transfer- und Seziervorgänge unpraktisch macht. - Um das Schlüpfen von Wirtseiern zu verhindern, setzen Sie die Wirtseikarten 30 Minuten ultravioletter (UV) Bestrahlung aus (Abbildung 1-i). Schneiden Sie anschließend das Papier mit inaktivierten Eiern in Eierkarten mit einer Dicke von 1 cm und einem Durchmesser von 8 cm, die jeweils etwa 300-500 Eier enthalten (Abbildung 1-ii)25,26,27.
- Führen Sie eine Kohorte von 80-120 T. denrolimi-Wespen in ein Glasröhrchen mit einem Durchmesser von 2 cm und einer Länge von 8 cm ein. Verschließen Sie den Schlauch mit Baumwolle.
HINWEIS: Halten Sie die Wespen bei einer Temperatur von 25 ± 1 °C, mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkelheit und halten Sie eine relative Luftfeuchtigkeit von ca. 75 % aufrecht. - Legen Sie den Wespen eine Wirtsei-Karte zur Parasitierung vor (Abbildung 1-ii). Lassen Sie die Wespen ihre Eier 6 Stunden lang in die Wirtseier legen, danach entfernen Sie die Wespen sofort.
HINWEIS: Vermeiden Sie eine übermäßige Verlängerung der Parasitierungsperiode, da dies zu einer Überfüllung der Nachkommen von T. denrolimi in einem Wirtsei führen kann, was zu einer erhöhten Wespensterblichkeit der Nachkommen führenkann 28,29.
2. Synthese von dsRNA
- Design-Primer-Sets mit einem T7-Promotor für die Synthese von doppelsträngiger RNA (dsRNA). Wählen Sie ein 300-400 bp-Segment aus dem Zielgen (Ferhch) für die dsRNA-Synthese.
- Beschaffung kommerziell synthetisierter Primer-Sets für die Herstellung von dsRNA für das Zielgen undds-GFP zur Verwendung als Negativkontrolle.
- Extrahieren Sie den RNA-Gehalt von 100 T. denrolimi-Wespen mit dem referenzierten Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers9. Überprüfen Sie die Qualität des RNA-Gehalts; Fahren Sie fort, wenn der Wert von OD260/OD280 zwischen 1,8 und 2,09 liegt.
- Reinigen Sie den RNA-Gehalt mit 2 μl 5x-Puffer (1 U/50 μl), 1 μl DNAse (1 U/50 μl) und 6,5 μl RNA (~100 ng/μl), 0,5 μl H2O bei 42 °C für 2 min.
- Führen Sie eine Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) durch, um ein cDNA-Template mit 10 μl gereinigter RNA (~100 ng/μl), 4 μl 5x-Puffer (1 U/50 μl), 1 μl Enzymmix I (1 U/50 μl) und 4 μl H2O zu erzeugen. Führen Sie die RT-PCR mit den folgenden Einstellungen durch: 37 °C für 15 min, 85 °C für 5 s. Lagern Sie das cDNA-Produkt bis zur Verwendung bei -4 °C.
- Führen Sie eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durch, um die dsRNA-Sequenzen gemäß dem referenzierten Mastermix zu amplifizieren (10 μl Taq II [1 U/50 μl], 0,8 μl Vorwärtsprimer [0,4 μM], 0,8 μl Reverse-Primer [0,4 μM], 0,8 μl DNA-Template [40 ng/μl] und 7,6 μl H2O). Führen Sie die PCR mit den folgenden Einstellungen durch: 94 °C für 2 Minuten; 35 Zyklen mit 94 °C für 30 s, 60 °C für 30 s, 72 °C für 30 s; 72 °C für 2 Min.
- Beurteilen Sie die Qualität von PCR-Produkten durch Elektrophorese auf einem 2,0%igen Agarosegel 5,9 und bestätigen Sie die Zielsequenz durch Sanger-Sequenzierung.
- Reinigen Sie das PCR-Produkt mit dem Gel-Extraktionskit gemäß den Richtlinien des Herstellers 9,23.
- Verwenden Sie ein RNAi-System zur Synthese von dsRNA für das Zielgen mit 10 μl 2x-Puffer (0,02 U/μl), 8 μl DNA-Template (75 ng/μl) und 2 μl Enzymmischung (1 U/50 μl) mit den folgenden Einstellungen: 37 °C für 30 min, 70 °C für 10 min und 25 °C für 20 min. Eluieren Sie die synthetisierte dsRNA mit 30 μl nukleasefreiem Wasser.
- Beurteilen Sie die Qualität des dsRNA-Produkts, indem Sie es auf einem 1,0%igen Agarosegelvisualisieren 5,9. Verdünnen Sie die dsRNA auf 7.000 ng/μl. Überprüfen Sie die Qualität des dsRNA-Produkts. Fahren Sie fort, wenn der Wert von OD260/OD280 zwischen 1,8 und 2,09 liegt. Lagern Sie das dsRNA-Produkt bis zur Verwendung bei -20 °C.
3. Transplantation von T. denrolimi-Puppen
- Kultivieren Sie die parasitierten Wirtseier etwa 8 Tage lang bei 25 ± 1 °C und halten Sie dabei einen 16-stündigen Licht-/8-Stunden-Dunkelzyklus und eine relative Luftfeuchtigkeit von ~75 % ein. Die parasitierten Wirtseier werden nach 5 Tagen schwarz30 (Abbildung 1-iv,v).
- Übertragen Sie die Wirtseikarte in ein Seziermikroskop. Verwenden Sie ein Paar Wolframnadeln (Abbildung 1-vi), um das Chorion sorgfältig aus den Wirtseiern zu entfernen (Abbildung 1-vii) und die Puppe von innen zu entnehmen (Abbildung 1-viii)5,17,18.
HINWEIS: Die Spitze der Präpariernadel sollte weniger als 0,05 mm betragen. - Bereiten Sie eine saubere Platte für den Untergrund vor. Gießen Sie 10-15 ml einer 15 g/l Agarlösung aus und lassen Sie sie auf natürliche Weise abkühlen (Abbildung 2-i).
HINWEIS: Mischen Sie die Agarlösung mit 0,5 g Streptomycin, um das Wachstum von Verunreinigungen in vitro zu hemmen. - Verwenden Sie einen desinfizierten Stichel, um mehrere Rillen mit einer Tiefe von 0,2 bis 0,3 mm und einer Breite von 0,4 bis 0,8 mm zu ätzen (Abbildung 2-ii).
- Verwenden Sie eine kleine Bürste (Abbildung 2-iii), um eine Puppe aus dem sezierten Wirtseier in eine der Rillen auf dem Agarsubstrat zu transplantieren (Abbildung 2-iv).
- Wiederholen Sie die Schritte 3.4 und 3.5 und verpflanzen Sie nacheinander 100-300 Puppen einzeln in die Rillen (Abbildung 2-v).
4. Mikroinjektion von dsRNA in T. denrolimi-Puppe
- Verwenden Sie einen Glasnadelzieher, um eine Glaskapillare zu ziehen (Abbildung 3-i, ii). Stellen Sie die Hitze auf 280, die Geschwindigkeit auf 170, die Verzögerung auf 250 und den Zug auf 30 an einem Nadelabzieher ein (Abbildung 3-iii). Bereiten Sie mehrere Kapillarglasnadeln für die Mikroinjektion vor (Abbildung 3-iv,v).
- Schrägen Sie die Spitze der Glasnadel mit einer Schleifplatte ab (Abbildung 3-vi).
Anmerkungen: Stellen Sie sicher, dass die Spitze der Injektionsnadel scharf bleibt; Andernfalls kann es zur Puppensterblichkeit führen oder den Reagenzfluss durch die Nadel behindern (Abbildung 3-vii). - Laden Sie etwa 2 μl der dsRNA-Injektionslösung mit 7.000 ng/μl mit einer Mikroinjektionspumpe in die vorbereitete Injektionsnadel (Abbildung 3-vii).
- Übertragen Sie das Agarsubstrat mit Hunderten von Puppen auf die Plattform eines Verbundmikroskops (Abbildung 3-viii).
- Führen Sie die Injektionsnadel vorsichtig in einem Winkel von ~30° zum Bauch unter der Linse in den Bauch einer T. denrolimi-Puppe ein (Abbildung 3-ix).
- Nach und nach ~5 nL der Injektionslösung (Schritt 4.3) so sanft wie möglich in die T. denrolimi-Puppe injizieren.
HINWEIS: Die T. denrolimi-Puppe kann leicht anschwellen, wenn die dsRNA-Lösung injiziert wird. Das Injizieren einer übermäßigen Menge Lösung in die Puppe oder die Verwendung von Nadeln mit zu großen Öffnungen kann zum vorzeitigen Tod der Puppe führen. Wechseln Sie die Nadeln, wenn sie nach der Injektion mehrerer bis zehn Puppen verstopft sind. - Wiederholen Sie die Schritte 4.5 und 4.6 und injizieren Sie dsRNA nacheinander in 600 Puppen.
HINWEIS: Für eine zuverlässige RT-qPCR-Analyse sollte der RNA-Gehalt aus mindestens 100 Puppen isoliert werden. Injizieren Sie mindestens 600 Puppen für drei Replikate in der dsRNA-Behandlung und drei Replikate in der dsGFP-Negativkontrolle 9.
5. Inkubation von T. denrolimi-Puppen
- Das Substrat mit den injizierten Puppen wird bei 25 ± 1 °C mit einem Hell-/Dunkelzyklus von 16 h/8 h und ~75 % relativer Luftfeuchtigkeit in einen Inkubator überführt.
- Inkubieren Sie etwa 700 T. denrolimi-Puppen pro Behandlung für entweder 24 Stunden oder 48 Stunden. Extrahieren Sie den RNA-Gehalt aus einer Gruppe von 100 Puppen pro Replikat9.
HINWEIS: Entfernen Sie die geschrumpften Puppen (tote Puppen) aus den Proben; Andernfalls kann es zu Fehlern beim Nachweis der Genexpression kommen. - Inkubieren Sie ~50 T. denrolimi-Puppen pro Behandlung, bis die Wespen schlüpfen (Abbildung 3-x). Notieren Sie die Emergenzrate und die Deformitätsrate.
6. Nachweis der gezielten Genexpression
- Entwerfen Sie das Primer-Set für das Zielgen und die Referenzgene für die RT-qPCR mit einem Design-Tool.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich die Sequenzen der RT-qPCR-Primer nicht mit der Zielregion der dsRNA überlappen. - Verwenden Sie das Gen Forkhead Box O (FoxO) als Referenzgen in der RT-qPCR-Analyse. über die Primer von FoxO wurde bereits berichtet9.
- Besorgen Sie sich kommerziell synthetisierte Primer-Sets. Durchführung der RT-qPCR mit 10 μl Taq II (1 U/50 μl), 0,8 μl Vorwärtsprimer (0,4 μM), 0,8 μl Reverse-Primer (0,4 μM), 0,8 μl Template (10 ng/μl) und 7,6 μl H2O. Durchführung der RT-qPCR mit den folgenden Einstellungen: 95 °C für 30 s; 35 Zyklen mit 95 °C für 5 s, 57 °C für 30 s, 72 °C für 30; 95 °C für 10 s; 60 °C für 5 s und 95 °C für 5 s.
- Berechnen Sie den Expressionswert des Zielgens mit der 2-ΔΔCt-Methode 9,25.
- Verwenden Sie den Kruskal-Wallis-Test, um die Expression des Zielgens unter dem Einfluss verschiedener Behandlungen (dsFerhch, dsGFP, Nicht-Injektion) zu analysieren.
HINWEIS: Vermeiden Sie die Verwendung parametrischer Tests (z. B. t-Test) für Post-hoc-Vergleiche, da die Heteroskedastizität und Nicht-Normalität der Daten zu falschen Schlussfolgerungen führen können25.
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Representative Results
Die Emergenzrate von T. denrolimi-Puppen , denen dsFerhch injiziert wurde, war signifikant niedriger als die von denjenigen, denen dsGFP injiziert wurde, oder derjenigen, denen dsGFP injiziert wurde (Tabelle 1). Unter den geschlüpften Wespen entwickelten 51,85 % der T. denrolimi-Wespen , die dsFerhch ausgesetzt waren, deformierte kleine Flügel. Die deformierten Wespen wurden bei den Wespen, denends GFP injiziert wurde, oder ohne Injektion nicht beobachtet (Tabelle 1). Darüber hinaus zeigten die Abdomen von T. denrolimi-Puppen , denen dsFerhch injiziert wurde, Melanismus, der der Phänotyp des abnormalen Eisenstoffwechsels ist23. Der Melanismus wurde bei T. denrolimi-Puppen , denen dsGFP injiziert wurde, oder bei solchen ohne Injektion nicht beobachtet (Abbildung 4).
Die RT-qPCR-Analyse zeigte, dass die Expression von Ferhch in T. denrolimi-Puppen 24 h nach dsFerhch-Injektion (0,6460 ± 0,0056) im Vergleich zu denen, denen dsGFP injiziert wurde (1,4514 ± 0,5402; P = 0,0415). Sie unterschied sich jedoch nicht signifikant von der Expression in Puppen ohne Injektion (1,0000 ± 0,1953; P = 0,8725). Die Ferhch-Expression in T. denrolimi-Puppen , 48 Stunden nach dsFerhch-Injektion (0,5170 ± 0,0575), war im Vergleich zu Puppen, die mit dsGFP injiziert wurden (0,8515 ± 0,0233; P = 0,0182) und solche ohne Injektion (1,0548 ± 0,3006; P = 0,0113) (Abbildung 5).
Abbildung 1: Sammlung und Pflege der Trichogramma denrolimi-Kultur . (i) Setzen Sie die Wirtseikarten ultravioletter (UV) Strahlung aus. (ii) Schneiden Sie das Papier mit inaktivierten Eiern in Eierkarten. (iii) Legen Sie den Wespen eine Wirtsei-Karte zur Parasitierung vor. (iv) Kultivieren Sie die parasitierten Wirtseier 8 Tage lang. (v) Die parasitierten Wirtseier werden nach 5 Tagen schwarz. (vi) Die Präpariernadel mit einer 0,04-mm-Spitze. (vii) Entfernen Sie das Chorion aus den Wirtseiern. (viii) T. denrolimi pupa. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Transplantation und Inkubation von Trichogramma denrolimi-Puppen . (i) Das Agarsubstrat. (ii) Verwenden Sie einen desinfizierten Stichel, um mehrere Rillen auf das Substrat zu ätzen. (iii) Verwenden Sie eine kleine Bürste, um (iv) die Puppen aus dem sezierten Wirtseier in eine Rille auf dem Substrat zu transplantieren. (v) Verpflanzung von 100-300 Puppen einzeln in die Rillen, eine nach der anderen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Ablauf der Mikroinjektion. (i) Glaskapillare. (ii) Glasnadelzieher. (iii) Einstellungen für den Nadelzieher. (iv) Bereiten Sie mehrere Kapillarglasnadeln für die Mikroinjektion vor. (v) Die Spitze der Kapillarglasnadel. (vi) Schrägen Sie die Spitze der Glasnadel mit einer Schleifplatte ab. (vii) Laden Sie etwa 2 μl der dsRNA-Injektionslösung. (viii) Zusammengesetztes Mikroskop. (ix) Führen Sie die Injektionsnadel in den Bauch ein und injizieren Sie die Injektionslösung. (x) Schlüpfen von Wespen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Morphologische Merkmale von Trichogramma denrolimi Puppe und Wespe. Die Puppe und Wespe, die mit dsFerhch injiziert wurden, zeigen Melanismus mit geschwärzter Körperfarbe. Die Wespe, die mit dsFerhch injiziert wurde, zeigt ein Paar deformierter kleiner Flügel. Melanismus und deformierte Flügel werden bei der Puppe und Wespe, die mit dsGFP injiziert wurde, oder bei solchen ohne Injektion nicht beobachtet. Maßstabsleisten = 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Expression des Zielgens Ferhch im Vergleich zu FoxO 24 h und 48 h nach dsFerhch - oderds GFP-Injektion oder Nicht-Injektion. Fehlerbalken zeigen die Standardfehler an. Unterschiedliche Kleinbuchstaben zeigen einen signifikanten Unterschied bei P < 0,05 an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Variablen | dsFerhch | dsGFP | Keine Injektion | χ2 | P |
| Entstehungsrate | 54.00% (27/50) Mrd. | 78,00% (39/50) a | 90,00 % (45/50) a | 17.46 | <.001 |
| Deformitätsrate | 51.85% (14/27) A | 0% (0/39) Mrd. | 0% (0/45) Mrd. | 49.84 | <.001 |
Tabelle 1: Das Auftreten und die Deformität von Trichogramma denrolimi , das durchds Ferhch,ds GFP oder ohne Injektion injiziert wurde. Verschiedene Kleinbuchstaben weisen auf signifikante Unterschiede in der Emergenzrate bei P < 0,05 hin. Unterschiedliche Großbuchstaben weisen auf signifikante Unterschiede in der Deformitätsrate bei P < 0,05 hin. Die in der Tabelle aufgeführten Werte von χ2 und P werden durch den unabhängigen Test χ2 geschätzt und geben die Gesamtwirkung von drei Behandlungsstufen auf die Emergenzrate und die Deformitätsrate an.
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Discussion
Trichogramma-Wespen sind als wirksame biologische Bekämpfungsmittel anerkannt, die speziell auf eine Reihe von Lepidoptera-Schädlingen in der Land- und Forstwirtschaft abzielen1. Diese winzigen Wespen durchlaufen ihre unreifen Stadien im Wirtsei, eine Eigenschaft, die bei der Durchführung von RNAi-Experimenten eine Herausforderung darstellt 5,18. Diese Studie bietet einen umfassenden visuellen Leitfaden für die Durchführung von RNAi-Experimenten in T. denrolimi. Angesichts der gemeinsamen biologischen Merkmale der Trichogramma-Arten kann das Verfahren mit einigen Anpassungen leicht für RNAi-Studien oder Mikroinjektionen bei anderen Trichogramma-Arten und endoparasitären Arten angepasst werden.
Das Verfahren führt mehrere innovative Ansätze ein, die effiziente Mikroinjektionen des dsRNA-Gehalts erleichtern, den RT-qPCR-Prozess für T. denrolimi rationalisieren und die Transplantation und Inkubation von T. denrolimi-Puppen optimieren. Laut dieser Studie erreichte die Emergenzrate transplantierter Puppen ohne Injektion 90%. Wenn die transplantierten Puppen einer dsGFP-Injektion unterzogen wurden, betrug die Emergenzrate dieser Puppen 78% (Tabelle 1). Erfolgreiche RNAi-Experimente in Trichogramma hängen maßgeblich von präzisen Mikroinjektionen und der sorgfältigen Inkubation von Puppen in vitro ab. Die Anfälligkeit isolierter Trichogramma-Puppen für Schäden während der Injektion kann auf übergroße Mikroinjektionsnadeln, hastige Injektionstechniken oder mikrobielle Kontamination des Agarsubstrats zurückzuführen sein. Die hier vorgestellte detaillierte visuelle Methode bietet auch Einblicke in die Mikroinjektionstechnik in T. denrolimi, die nicht nur für andere genetische Editierungswerkzeuge (z. B. CRISPR-Cas9-System), sondern auch für die Durchführung verschiedener physiologischer Experimente (z. B. künstliche Transinfektion von Symbionten und die Abgabe von Inhibitoren oder Aktivatoren physiologischer Reaktionen) unerlässlich ist1,14,15,16.
Für die RT-qPCR-Analyse wurden in dieser Studie etwa 1.500 Puppen injiziert. Aufgrund der geringen Größe von T. denrolimi sind mindestens 100 Puppen pro Replikat erforderlich, um eine ausreichende RNA-Qualität und -Quantität für die RT-qPCR-Analyse zu gewährleisten9. Daher ist die Injektion von dsRNA in Hunderte von Puppen unerlässlich. Darüber hinaus sind Verbesserungen des RNA-Isolierungsverfahrens (z. B. Verwendung eines spezifischen RNA-Extraktionskits, Verfeinerung von PCR-Programmen) erforderlich, um geeignete RNA-Gehalte von einer reduzierten Anzahl von Trichogramma-Individuen pro Replikat zu erhalten. Ein alternativer Ansatz beinhaltet die Verabreichung von dsRNA durch Einweichen oder Füttern, was bequemer sein kann, um eine beträchtliche Anzahl von Personen zu erhalten, die dsRNA ausgesetzt sind. Darüber hinaus ist es wichtig zu beachten, dass das derzeitige RNAi-Verfahren nur im Puppenstadium von T. denrolimi anwendbar ist. Zukünftige Forschungen sollten einen besonderen Schwerpunkt auf die Entwicklung effizienter RNAi-Methoden für das Embryo- und Larvenstadium legen15,16.
Zusammenfassend hat diese Studie eine effiziente RNAi-Methode in T. denrolimi beschrieben. Jahrzehntelang wurden die Genfunktionen innerhalb der gesamten Gattung Trichogramma nur selten erforscht. Die vorliegende Methodik bietet ein robustes Modell zur Untersuchung der Genregulation während der Entwicklung und physiologischer Aktivitäten bei Trichogramma-Wespen. Zukünftige Forschung sollte die Entwicklung genetischer Werkzeuge wie Genom-Editierung und RNA-Interferenz bei Trichogramma-Wespen betonen. Die eingehende Erforschung der Molekularbiologie von Trichogramma-Wespen bietet wertvolle Erkenntnisse zur Verbesserung der Massenaufzuchteffizienz und der Feldleistung dieser biologischen Schädlingsbekämpfungsmittel 8,9.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde von den Projekten der National Natural Science Foundation of China (32172476, 32102275), dem Agricultural Science and Technology Innovation Program (CAAS-ZDRW202203, CAAS-ZDRW202108) und Central Funds Guiding the Local Science and Technology Development (XZ202301YD0042C) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2x ES Taq MasterMix (Dye) | Cowin Biotech, China | CW0690H | To amplify the dsRNA sequences |
| 20x PBS Buffer, DEPC treated (7.2-7.6) | Sangon Biotech, China | B540627-0500 | To dilute dsRNA |
| Agar strip | Shishi Globe Agar Industries Co.,Ltd, China | n/a | To make culture medium |
| Ampicillin sodium | Sangon Biotech, China | A610028 | To make culture medium |
| Bioer Constant temperature metal bath | BIOER, China | MB-102 | To synthesis dsRNA |
| Borosilicate glass capillary | WPI, USA | 1B100-4 | To pull capillary glass needle |
| Clean bench | Airtech, China | SW-CJ-1FD | To extract RNA |
| Double distilled water | Sangon Biotech, China | A500197-0500 | To dilute cDNA |
| Environmental Testing chamber | Panasonic, Japan | MLR-352H-PC | To culture T. denrolimi |
| Eppendorf Centrifuge | Eppendrof, Germany | 5418R | To store RNA content |
| Eppendorf FemtoJet 4i | Eppendrof, Germany | FemtoJet 4i | To inject T. denrolimi |
| Eppendorf Refrigerated Centrifuge | Eppendrof, Germany | 5810R | Centrifuge |
| Ethanol solution (75%, RNase-free) | Aladdin, China | M052131-500ml | To extract RNA |
| Gel Extraction Kit | Omega, USA | D25000-02 | To extract cDNA |
| GUM Arabic | Solarbio, China | CG5991-500g | To make egg card |
| Isopropyl alchohol | Aladdin, China | 80109218 | To extract RNA |
| Laser-Based Micropipette Puller | SUTTER, USA | P-2000 | To pull capillary glass needle |
| Microloader | Eppendrof, Germany | 20 µL | To load dsRNA |
| Multi-sample tissue grinder | LICHEN, China | LC-TG-24 | To grind T. denrolimi |
| Needle Grinder | SUTTER, USA | BV-10-E | To grind capillary glass needle |
| Nuclease-Free Water | Sangon Biotech, China | To dilute RNA | |
| OLYMPUS Microscope | OLYMPUS, Japan | XZX16 | To observe T. denrolimi |
| PCR machine | Bio-rad, USA | S-1000 | For DNA amplification |
| PowerPac Basic | Bio-rad, USA | PowerPacTM Basic | To detect the quality of dsRNA |
| Primer of dsGFP (Forward) | [TAATACGACTCACTATAGGG] ACAAACCAAGGCAAGTAATA |
||
| Primer of dsGFP (Reverse) | [TAATACGACTCACTATAGGG] CAGAGGCATCTTCAACG |
||
| Primer of Ferhch for qPCR (Forward) | TGAAGAGATTCTGCGTTCTGCT | ||
| Primer of Ferhch for qPCR (Reverse) | CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT | ||
| Primer of Ferhch for RNAi (Reverse) | [TAATACGACTCACTATAGGG]AG TAGCCATCATCTTTCC |
||
| Primer of Ferhch for RNAi(Forward) | [TAATACGACTCACTATAGGG] ACACTGTCAATCGTCCTG |
||
| Primer of FoxO for qPCR (Forward) | CTACGCCGATCTCATAACGC | ||
| Primer of FoxO for qPCR (Reverse) | TGCTGTCGCCCTTGTCCT | ||
| PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) | TaKaRa, Japan | RR047A | |
| Quantitative Real-time PCR | Bio-rad, USA | CFX 96 Touch | To perform reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) |
| Real-time PCR (TaqMan) Primer and Probes Design Tool | https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/ | ||
| T7 RiBoMAX Express RNAi System | Promega, USA | P1700 | To synthesis dsRNA in vitro |
TB Green Premix Ex TaqTM  (Til RnaseH Plus) |
TaKaRa, Japan | RR820A | To perform RT-qPCR |
| Trichloromethane | KESHI, China | GB/T682-2002 | To extract RNA |
| TRIzol Reagent | Ambion, USA | 15596018 | To extract total RNA content from samples |
| Ultra-low Temperature Freezer | Thermo, USA | Forma 911 |
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