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Biology

अंडे परजीवी में आरएनए हस्तक्षेप, ट्राइकोग्रामा डेंड्रोलिमी मात्सुमुरा

Published: November 21, 2023 doi: 10.3791/66250
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1,2, 1
1College of Plant Protection, Shenyang Agricultural University, 2State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences

Summary

आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) का हेरफेर कई परजीवी प्रजातियों में कम आकार के साथ एक दुर्जेय चुनौती प्रस्तुत करता है, जैसे कि ट्राइकोग्रामा ततैया। इस अध्ययन ने ट्राइकोग्रामा डेन्रोलिमी में एक कुशल आरएनएआई विधि को चित्रित किया। वर्तमान पद्धति ट्राइकोग्रामा ततैया में जीन विनियमन की जांच के लिए एक मजबूत मॉडल प्रदान करती है।

Abstract

अंडा परजीवी, ट्राइकोग्रामा एसपीपी, कृषि और जंगलों में विभिन्न लेपिडोप्टेरान कीटों के खिलाफ कुशल जैविक नियंत्रण एजेंटों के रूप में पहचाने जाते हैं। ट्राइकोग्रामा संतानों के अपरिपक्व चरण मेजबान अंडे के भीतर विकसित होते हैं, जो उल्लेखनीय कमी (वयस्क लंबाई में लगभग 0.5 मिमी) प्रदर्शित करते हैं। आरएनए-हस्तक्षेप (आरएनएआई) पद्धति कई जीवों में जीन कार्यों को स्पष्ट करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में उभरी है। हालांकि, ट्राइकोग्रामा जैसी कुछ छोटी परजीवी प्रजातियों में आरएनएआई में हेरफेर करने से आम तौर पर महत्वपूर्ण चुनौतियां सामने आई हैं। इस अध्ययन में, हम ट्राइकोग्रामा डेनोलिमी में एक कुशल आरएनएआई विधि प्रस्तुत करते हैं। उल्लिखित प्रक्रिया में मेजबान अंडे से व्यक्तिगत टी. डेंड्रोलिमी नमूनों का अधिग्रहण और अलगाव, डबल-स्ट्रैंडेड आरएनए (डीएसआरएनए) का डिजाइन और संश्लेषण, इन विट्रो प्रत्यारोपण और टी. डेंड्रोलिमी प्यूपा की खेती, डीएसआरएनए का माइक्रो-इंजेक्शन, और आरटी-क्यूपीसीआर विश्लेषण के माध्यम से लक्ष्य जीन नॉकडाउन का बाद का मूल्यांकन शामिल है। यह अध्ययन टी. डेंड्रोलिमी में आरएनएआई प्रयोगों के संचालन के लिए एक व्यापक, नेत्रहीन विस्तृत प्रक्रिया प्रस्तुत करता है, जिससे शोधकर्ताओं को इस प्रजाति में जीन विनियमन की जांच करने में सक्षम बनाया जा सके। इसके अलावा, यह पद्धति मामूली समायोजन के साथ अन्य ट्राइकोग्रामा प्रजातियों में आरएनएआई अध्ययन या सूक्ष्म इंजेक्शन के लिए अनुकूल है, जो इसे अन्य एंडोपैरासिटिक प्रजातियों में आरएनएआई प्रयोगों के संचालन के लिए एक मूल्यवान संदर्भ प्रदान करती है।

Introduction

ट्राइकोग्रामा एसपीपी अंडे परजीवी का एक समूह हैकि बड़े पैमाने पर दुनिया भर में कृषि और वन पारिस्थितिकी प्रणालियों 1,2,3,4 में लेपिडोप्टेरान कीटों की एक विस्तृत स्पेक्ट्रम के खिलाफ अत्यधिक कुशल जैविक नियंत्रण एजेंटों के रूप में उपयोग किया गया है. बड़े पैमाने पर पाले गए ट्राइकोग्रामा का अनुप्रयोगकीटों 5,6,7के स्थायी प्रबंधन के लिए पर्यावरण के अनुकूल दृष्टिकोण प्रदान करता है। ट्राइकोग्रामा ततैया के आणविक जीव विज्ञान को समझना जीन विनियमन और जीनोम संपादन10 की पद्धति की जांच करके इनजैविक नियंत्रण एजेंटों 8,9 के बड़े पैमाने पर पालन दक्षता और क्षेत्र प्रदर्शन को बढ़ाने में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।

1998 में Caenorhabditis एलिगेंस में डबल असहाय शाही सेना (dsRNA) की मध्यस्थता विशिष्ट आनुवंशिक हस्तक्षेप की खोज के बाद से, आरएनए-हस्तक्षेप (आरएनएआई) विधि लक्ष्य जीन11 की अभिव्यक्ति को दबाने से जीवों के नियामक तंत्र की खोज के लिए एक महत्वपूर्ण आनुवंशिक टूलकिट में विकसित हुई है। आरएनएआई प्रयोग एक मानक पद्धति बन गए हैं जो व्यापक रूप से कई कीट प्रजातियों 12,13में जीन फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए लागू होती है। फिर भी, आरएनएआई का हेरफेर कई परजीवी प्रजातियों में एक दुर्जेय चुनौती प्रस्तुत करता है, विशेष रूप से एंडोपैरासिटिक चाल्सीडोइडिया परिवार 14,15,16से संबंधित लोगों के बीच। आरएनएआई विधि को कम से कम 13 परजीवी प्रजातियों 14,15,16,17,18,19में प्रलेखित किया गया है। इनमें से, आरएनएआई दृष्टिकोण व्यापक रूप से नासोनिया ततैया में आयोजित किया गया है और भ्रूण, लार्वा, प्यूपा और वयस्कों 14,15,16सहित विकास के चरणों में लागू होता है। यह उल्लेखनीय है कि नासोनिया ततैया एक्टोपैरासिटोइड्स हैं, उनकी संतान मेजबान प्यूपा और प्यूपेरियम के बीच अंतरालीय स्थान में विकसित होती है, जिससे इन विट्रो में उनकी खेती सक्षम होती है और उन्हें माइक्रो-इंजेक्शन जैसे कुछ उपचारों को सहन करने में मदद मिलती है। नासोनिया ततैया के विपरीत, ट्राइकोग्रामा व्यक्ति मेजबान अंडे के अंदर अपने पूरे भ्रूण, लार्वा और प्यूपा विकास से गुजरते हैं। भ्रूण और लार्वा चरणों में परत (जो dsRNA पारगम्यता बाधित हो सकता है), क्षति के लिए भेद्यता, और इन विट्रो में जीवित रहने में कठिनाई दुर्जेय बाधाओं20,21,22. इसके अतिरिक्त, ट्राइकोग्रामा व्यक्तियों का छोटा आकार, वयस्क या प्यूपा लंबाई में लगभग ~ 0.5 मिमी, उन्हें20,21,22 में हेरफेर करने के लिए अत्यधिक जटिल बनाता है।

वर्तमान अध्ययन में, हम ट्राइकोग्रामा डेनोलिमी मात्सुमुरा में आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) प्रयोगों के संचालन के लिए एक व्यापक प्रक्रिया की रूपरेखा तैयार करते हैं। इस प्रक्रिया में निम्नलिखित प्रक्रियाएं शामिल हैं: (1) डबल-स्ट्रैंडेड आरएनए (dsRNA) का डिजाइन और संश्लेषण, (2) टी. डेनोलिमी प्यूपा का माइक्रोइंजेक्शन, (3) इन प्यूपा का प्रत्यारोपण और इन विट्रो इनक्यूबेशन, और (4) आरटी-क्यूपीसीआर विश्लेषण के माध्यम से लक्ष्य जीन नॉकडाउन का पता लगाना। आरएनएआई प्रयोग के लिए चुना गया लक्ष्य जीन फेरिटिन भारी श्रृंखला होमोलॉजी (फेरहच) है। FerHCH, एक लौह-बाध्यकारी प्रोटीन, में एंटीऑक्सिडेंट क्षमताओं के साथ संपन्न एक फेरोक्सीडेज केंद्र होता है, जो Fe2+ से Fe3+ के ऑक्सीकरण की सुविधा प्रदान करता है। यह रेडॉक्स संतुलन और लोहे के होमियोस्टेसिस को बनाए रखकर विभिन्न जीवों के विकास और विकास में एक अनिवार्य भूमिका निभाता है। FerHCH की कमी लोहे की overaccumulation में परिणाम कर सकते हैं, अपरिवर्तनीय ऊतक क्षति के लिए अग्रणी, और अक्सर महत्वपूर्ण फेनोटाइपिक परिवर्तन, विकास दोष, विकृति, औरमृत्यु दर 23,24 सहित में परिणति. यह अध्ययन टी. डेन्रोलिमी में आरएनएआई के संचालन के लिए चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका प्रदान करता है, जो ट्राइकोग्रामा ततैया के व्यापक संदर्भ में जीन कार्यों की जांच के लिए अमूल्य होगा।

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Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों, उपकरणों, सॉफ्टवेयर और अभिकर्मकों से संबंधित विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

1. कीट संस्कृति का संग्रह और रखरखाव

  1. गोंद अरबी पाउडर और पानी 25,26 के 1:5 (v/v) समाधान का उपयोग करके 9 सेमी बाय 16 सेमी कार्ड पर कोर्सीरा सेफलोनिका (स्टेनटन) के ~ 5,000 अंडों के समूह का पालन करें।
    नोट: कार्ड के लिए बहुत सारे मेजबान अंडे संलग्न करने से बचें क्योंकि भीड़भाड़ बाद में स्थानांतरण और विच्छेदन प्रक्रियाओं के लिए अव्यावहारिक बनाती है।
  2. मेजबान अंडे की हैचिंग को रोकने के लिए, मेजबान अंडे के कार्ड को पराबैंगनी (यूवी) विकिरण (चित्रा 1-i) के 30 मिनट के अधीन करें। इसके बाद, निष्क्रिय अंडे के साथ कागज को 1 सेमी मोटी और 8 सेमी व्यास के अंडा कार्ड में काटें, प्रत्येक में लगभग 300-500 अंडे (चित्र 1-द्वितीय)25,26,27.
  3. 80-120 टी डेनोलिमी ततैया के एक समूह को एक ग्लास ट्यूब में 2 सेमी व्यास और 8 सेमी लंबाई में मापने का परिचय दें। कपास के साथ ट्यूब सील.
    नोट: ततैया को 25 ± 1 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर बनाए रखें, जिसमें 16 घंटे प्रकाश और 8 घंटे का अंधेरा चक्र हो और लगभग 75% की सापेक्ष आर्द्रता बनाए रखें।
  4. परजीवीकरण के लिए ततैया को एक मेजबान अंडा कार्ड प्रस्तुत करें (चित्र 1-ii)। ततैया को अपने अंडे को 6 घंटे के लिए मेजबान अंडे में जमा करने की अनुमति दें, जिसके बाद तुरंत ततैया को हटा दें।
    नोट: परजीवीकरण अवधि को अत्यधिक लम्बा करने से बचें क्योंकि इससे एक मेजबान अंडे के भीतर टी. डेनोलिमी संतानों की भीड़भाड़ हो सकती है, जिसके परिणामस्वरूप संतान ततैया मृत्यु दर28,29 बढ़ जाती है।

2. dsRNA का संश्लेषण

  1. डबल-फंसे आरएनए (dsRNA) के संश्लेषण के लिए एक T7 प्रमोटर युक्त प्राइमर सेट डिज़ाइन करें। डीएसआरएनए संश्लेषण के लिए लक्षित जीन (फेरहच) से 300-400 बीपी खंड चुनें।
  2. लक्षित जीन के लिए dsRNA के उत्पादन के लिए व्यावसायिक रूप से संश्लेषित प्राइमर सेट प्राप्त करें और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग के लिएds GFP प्राप्त करें।
  3. निर्माता के प्रोटोकॉल9 के बाद संदर्भित किट का उपयोग करके 100 टी डेनोलिमी ततैया से आरएनए सामग्री निकालें। आरएनए सामग्री की गुणवत्ता की जांच करें; यदि OD260/OD280 का मान 1.8 से 2.09 तक है तो आगे बढ़ें।
  4. 5x बफर (1 U/50 μL) के 2 μL, डीएनए के 1 μL (1 U/50 μL), और RNA के 6.5 μL (~100 ng/μL) के साथ RNA सामग्री को शुद्ध करें, H2O के 0.5 μL 42 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए।
  5. शुद्ध आरएनए (~ 100 एनजी / μL) के 10 माइक्रोन के साथ सीडीएनए टेम्पलेट उत्पन्न करने के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर) करें, 5x बफर के 4 माइक्रोन (1 यू / 50 माइक्रोन), एंजाइम मिक्स I के 1 माइक्रोन (1 यू / 50 माइक्रोन), और एच2ओ के 4 माइक्रोन। निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करके आरटी-पीसीआर करें: 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5 एस के लिए 85 डिग्री सेल्सियस। उपयोग होने तक सीडीएनए उत्पाद को -4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  6. संदर्भित मास्टर मिक्स (Taq II के 10 μL [1 U/50 μL], फॉरवर्ड प्राइमर के 0.8 μL [0.4 μM], रिवर्स प्राइमर के 0.8 μL [0.4 μM], 0.8 μL ऑफ रिवर्स प्राइमर [0.4 μM], डीएनए टेम्पलेट के 0.8 μL [40 ng/μL], और H2O के 7.6 μL) के अनुसार dsRNA अनुक्रमों को बढ़ाने के लिए पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (PCR) करें। निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग कर पीसीआर प्रदर्शन: 2 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस; 30 एस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के साथ 35 चक्र, 30 एस के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, 30 के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; 2 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस।
  7. 2.0% एगरोज जेल 5,9 पर वैद्युतकणसंचलन द्वारा पीसीआर उत्पादों की गुणवत्ता का आकलन करें और सेंगर अनुक्रमण के माध्यम से लक्ष्य अनुक्रम की पुष्टि करें।
  8. निर्माताके दिशानिर्देशों 9,23 के अनुसार जेल निष्कर्षण किट का उपयोग करके पीसीआर उत्पाद को शुद्ध करें।
  9. 2x बफर (0.02 U/μL) के 10 μL के साथ लक्ष्य जीन के लिए dsRNA को संश्लेषित करने के लिए एक RNAi प्रणाली का उपयोग करें, डीएनए टेम्पलेट के 8 μL (75 ng/μL), और एंजाइम मिश्रण के 2 μL (1 U/50 μL) निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ: 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस, और 20 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस। न्यूक्लियस मुक्त पानी के 30 माइक्रोन के साथ संश्लेषित डीएसआरएनए को एल्यूट करें।
  10. इसे 1.0% एगरोज जेल 5,9 पर कल्पना करके डीएसआरएनए उत्पाद की गुणवत्ता का आकलन करें। dsRNA को 7,000 ng/μL तक पतला करें। dsRNA उत्पाद की गुणवत्ता की जाँच करें; यदि OD260/OD280 का मान 1.8 से 2.09 तक है तो आगे बढ़ें। उपयोग होने तक dsRNA उत्पाद को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. टी. डेनोलिमी प्यूपा का प्रत्यारोपण

  1. परजीवी मेजबान अंडे को लगभग 8 दिनों के लिए 25 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर खेती करें, 16 घंटे प्रकाश/8 घंटे अंधेरे चक्र और ~ 75% की सापेक्ष आर्द्रता बनाए रखें। परजीवी मेजबान अंडे 5 दिनों30 (चित्रा 1-iv, v) के बाद काले हो जाएंगे।
  2. मेजबान अंडा कार्ड को एक विदारक माइक्रोस्कोप में स्थानांतरित करें। मेजबान अंडे (चित्रा 1-vii) से कोरियोन को सावधानीपूर्वक हटाने के लिए टंगस्टन सुइयों (चित्रा 1-vi) की एक जोड़ी को नियोजित करें और प्यूपा को भीतर से पुनः प्राप्त करें (चित्र 1-आठ)5,17,18.
    नोट: विदारक सुई की नोक 0.05 मिमी से कम होनी चाहिए।
  3. सब्सट्रेट के लिए एक साफ थाली तैयार करें। एक 15 ग्राम/एल अगर समाधान के 10-15 एमएल बाहर डालो, यह स्वाभाविक रूप से ठंडा करने के लिए अनुमति (चित्रा 2-मैं).
    नोट: इन विट्रो में दूषित पदार्थों के विकास को रोकने के लिए स्ट्रेप्टोमाइसिन के 0.5 ग्राम के साथ अगर समाधान मिलाएं।
  4. गहराई में 0.2-0.3 मिमी और चौड़ाई में 0.4-0.8 मिमी मापने वाले कई खांचे खोदने के लिए एक कीटाणुरहित ग्रेवर को नियोजित करें (चित्र 2-द्वितीय)।
  5. अगर सब्सट्रेट (चित्रा 2-iv) पर खांचे में से एक में विच्छेदित मेजबान अंडे से एक प्यूपा प्रत्यारोपण करने के लिए एक छोटे ब्रश (चित्रा 2-iii) का प्रयोग करें।
  6. चरण 3.4 और 3.5 दोहराएं, 100-300 प्यूपा को व्यक्तिगत रूप से एक-एक करके खांचे में प्रत्यारोपित करें (चित्र 2-वी)।

4. टी. denrolimi प्यूपा में माइक्रो-इंजेक्शन dsRNA

  1. एक ग्लास केशिका खींचने के लिए एक ग्लास सुई खींचने वाले का उपयोग करें (चित्र 3-i, ii)। गर्मी को 280, वेग को 170, देरी को 250, और सुई खींचने वाले (चित्र 3-iii) पर 30 पर सेट करें। माइक्रोइन्जेक्शन के लिए कई केशिका ग्लास सुई तैयार करें (चित्र 3-चतुर्थ, वी)।
  2. एक अपघर्षक प्लेट (चित्रा 3-vi) का उपयोग कर कांच की सुई की नोक बेवल.
    नोट: सुनिश्चित करें कि इंजेक्शन सुई की नोक तेज रहती है; अन्यथा, यह प्यूपा मृत्यु दर या सुई (चित्रा 3-vii) के माध्यम से अभिकर्मक प्रवाह में बाधा हो सकती है.
  3. एक माइक्रो-इंजेक्शन पंप(चित्रा 3-vii)का उपयोग करके तैयार इंजेक्शन सुई में 7,000 एनजी/माइक्रोन के साथ डीएसआरएनए इंजेक्शन समाधान के लगभग 2 माइक्रोन लोड करें।
  4. एक यौगिक माइक्रोस्कोप (चित्रा 3-viii) के मंच पर प्यूपा के सैकड़ों युक्त अगर सब्सट्रेट स्थानांतरण.
  5. लेंस के नीचे पेट के लिए ~ 30 डिग्री कोण पर एक टी डेनोलिमी प्यूपा के पेट में इंजेक्शन सुई डालें (चित्र 3-ix)।
  6. धीरे-धीरे इंजेक्शन समाधान (चरण 4.3) के ~ 5 एनएल को टी. डेनोलिमी प्यूपा में यथासंभव धीरे इंजेक्ट करें।
    नोट: टी. डेनोलिमी प्यूपा थोड़ा सूज सकता है क्योंकि डीएसआरएनए समाधान इंजेक्ट किया जाता है। प्यूपा में अत्यधिक मात्रा में घोल इंजेक्ट करने या अत्यधिक बड़े उद्घाटन वाली सुइयों का उपयोग करने से समय से पहले प्यूपा की मृत्यु हो सकती है। सुइयों को बदलें जब वे कई से दसियों प्यूपा इंजेक्शन लगाने के बाद बंद हो जाते हैं।
  7. चरण 4.5 और 4.6 दोहराएं, एक के बाद एक 600 प्यूपा में डीएसआरएनए इंजेक्ट करें।
    नोट: विश्वसनीय आरटी-क्यूपीसीआर विश्लेषण के लिए, आरएनए सामग्री को कम से कम 100 प्यूपा से अलग किया जाना चाहिए। डीएसआरएनए उपचार में तीन प्रतिकृतियों के लिए कम से कम 600 प्यूपा इंजेक्ट करें और डीएसजीएफपी नकारात्मक नियंत्रण9 में तीन प्रतिकृतियां करें।

5. टी. डेनोलिमी प्यूपा का इनक्यूबेशन

  1. इंजेक्शन प्यूपा युक्त सब्सट्रेट को 16 एच/8 घंटे प्रकाश/अंधेरे चक्र और ~ 75% आरएच के साथ 25 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें।
  2. लगभग 700 टी. denrolimi pupae या तो 24 घंटे या 48 घंटे के लिए उपचार प्रति सेते हैं. प्रति प्रतिकृति100 प्यूपा के समूह से आरएनए सामग्री निकालें 9.
    नोट: नमूनों से सिकुड़ा हुआ प्यूपा (मृत प्यूपा) निकालें; अन्यथा, इसके परिणामस्वरूप जीन अभिव्यक्ति का पता लगाने में त्रुटियां हो सकती हैं।
  3. इनक्यूबेट ~ 50 टी. denrolimi pupae उपचार प्रति जब तक ततैया उभरने (चित्रा 3-x). उद्भव दर और विकृति दर रिकॉर्ड करें।

6. लक्षित जीन अभिव्यक्ति का पता लगाना

  1. एक डिजाइन उपकरण का उपयोग आरटी-क्यूपीसीआर के लिए लक्ष्य जीन और संदर्भ जीन के लिए प्राइमर सेट डिजाइन करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि आरटी-क्यूपीसीआर प्राइमरों के अनुक्रम डीएसआरएनए के लक्षित क्षेत्र के साथ ओवरलैप नहीं करते हैं।
  2. आरटी-क्यूपीसीआर विश्लेषण में संदर्भ जीन के रूप में जीन फोर्कहेड बॉक्स ओ (फॉक्सओ) को नियोजित करें; फॉक्सओ के प्राइमरों को पहले9 बताया गया है।
  3. व्यावसायिक रूप से संश्लेषित प्राइमर सेट प्राप्त करें। Taq II (1 U/50 μL) के 10 μL, फॉरवर्ड प्राइमर के 0.8 μL (0.4 μM), रिवर्स प्राइमर के 0.8 μL (0.4 μM), टेम्पलेट के 0.8 μL (10 ng/μL), और H2O के 7.6 μL के साथ RT-qPCR करें। निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करके RT-qPCR करें: 95 s के लिए 30 °C; 5 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के साथ 35 चक्र, 30 एस के लिए 57 डिग्री सेल्सियस, 30 के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; 10 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; 5 एस के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, और 5 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस।
  4. 2-ΔΔCt विधि 9,25 का उपयोग करके लक्षित जीन की अभिव्यक्ति मूल्य की गणना.
  5. विभिन्न उपचारों (dsFerhch, dsGFP, गैर-इंजेक्शन) के प्रभाव में लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए Kruskal-Wallis परीक्षण को नियोजित करें।
    नोट: पोस्ट-हॉक तुलना के लिए पैरामीट्रिक परीक्षणों (जैसे, टी-टेस्ट) का उपयोग करने से बचें क्योंकि डेटा की विषमता और गैर-सामान्यता गलत निष्कर्ष25 को जन्म दे सकती है।

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Representative Results

DsFerhch के साथ इंजेक्ट किए गए T. denrolimi pupae की उद्भव दर dsGFP या इंजेक्शन के बिना उन लोगों की तुलना में काफी कम थी (तालिका 1)। उभरे ततैया के बीच, 51.85% टी. डेनोलिमी ततैया dsFerhch के अधीन विकृत छोटे पंख विकसित किए। विकृत ततैया डीएसजीएफपी के साथ या बिना किसी इंजेक्शन (तालिका 1) के इंजेक्शन में नहीं देखी गई थी। इसके अलावा, टी के पेट denrolimi pupae dsFerhch के साथ इंजेक्शन मेलेनिज़्म जो असामान्य लोहे चयापचय23 के फेनोटाइप है का प्रदर्शन किया. मेलेनिज़्म टी. denrolimi प्यूपा dsGFP या किसी भी इंजेक्शन (चित्रा 4) के बिना उन लोगों के साथ इंजेक्शन में नहीं मनाया गया था.

आरटी-क्यूपीसीआर विश्लेषण से पता चला है कि डी.एसफेर्च इंजेक्शन (0.6460 ± 0.0056) के बाद 24 घंटे में टी. डेनोलिमी प्यूपा में फर्च की अभिव्यक्ति, डीएसजीएफपी (1.4514 ± 0.5402; पी = 0.0415)। हालांकि, यह बिना किसी इंजेक्शन के प्यूपा में अभिव्यक्ति से काफी भिन्न नहीं था (1.0000 ± 0.1953; पी = 0.8725)। डेनोलिमी प्यूपा, 48 एच पोस्ट डीएसफेर्च इंजेक्शन (0.5170 ± 0.0575), डीएसजीएफपी (0.8515 ± 0.0233) के साथ इंजेक्शन वाले प्यूपा की तुलना में काफी डाउनरेगुलेट किया गया था; पी = 0.0182) और बिना किसी इंजेक्शन के (1.0548 ± 0.3006; पी = 0.0113) (चित्रा 5)।

Figure 1
चित्रा 1: ट्राइकोग्रामा डेनोलिमी संस्कृति का संग्रह और रखरखाव। (i) मेजबान अंडे के कार्डों को पराबैंगनी (यूवी) किरणन के संपर्क में लाना। (ii) निष्क्रिय अंडे वाले कागज को एग कार्ड में काटें। (iii) परजीवीकरण के लिए ततैया को एक मेजबान अंडा कार्ड प्रस्तुत करें। (iv) परजीवीकृत परपोषी अण्डों की खेती 8 दिनों तक करें। (v) परजीवी मेजबान अंडे 5 दिनों के बाद काले हो जाएंगे। (vi) 0.04 मिमी टिप के साथ विदारक सुई। (vii) मेजबान अंडे से जमाना निकालें। (viii) टी डेन्रोलिमी प्यूपा। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: ट्राइकोग्रामा डेनोलिमी प्यूपा का प्रत्यारोपण और इनक्यूबेशन ।(i) अगर सब्सट्रेट। (ii) सब्सट्रेट पर कई खांचे खोदने के लिए एक कीटाणुरहित ग्रेवर को नियोजित करें। (iii) एक छोटे ब्रश का उपयोग करें (iv) विच्छेदित मेजबान अंडे से प्यूपा को सब्सट्रेट पर एक खांचे में प्रत्यारोपित करें। (v) 100-300 प्यूपा को अलग-अलग खांचे में एक-एक करके रोपाई करना। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: माइक्रो-इंजेक्शन की प्रक्रिया। (i) कांच केशिका। (ii) कांच की सुई खींचने वाला। (iii) सुई खींचने वाले के लिए सेटिंग्स। (iv) माइक्रोइन्जेक्शन के लिए कई केशिका कांच की सुई तैयार करें। (v) केशिका कांच की सुई की नोक। (अपघर्षक प्लेट का उपयोग करके काँच की सुई की नोक को मोड़िए। (vii) dsRNA इंजेक्शन समाधान के लगभग 2 μL लोड करें। (viii) यौगिक सूक्ष्मदर्शी। (ix) इंजेक्शन की सुई को पेट में डालें और इंजेक्शन के घोल को इंजेक्ट करें। (x) ततैया का उद्भव। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: ट्राइकोग्रामा डेनोलिमी प्यूपा और ततैया की रूपात्मक विशेषताएं। डीएसफेरहच के साथ इंजेक्ट किए गए प्यूपा और ततैया काले शरीर के रंग के साथ मेलेनिज़्म प्रदर्शित करते हैं। डीएसफेरच के साथ इंजेक्ट किया गया ततैया विकृत छोटे पंखों की एक जोड़ी दिखाता है। मेलेनिज़्म और विकृत पंख प्यूपा और ततैया में नहीं देखे जाते हैं जिन्हें डीएसजीएफपी या बिना किसी इंजेक्शन के इंजेक्शन दिया जाता है। स्केल सलाखों = 200 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: 24 घंटे और 48 घंटे पोस्ट डीएसफेरच या डीएसजीएफपी इंजेक्शन, या गैर-इंजेक्शन पर फॉक्सओ के सापेक्ष लक्ष्य जीन फेरच की अभिव्यक्ति। त्रुटि पट्टियाँ मानक त्रुटियों को इंगित करती हैं. विभिन्न लोअरकेस अक्षर P < 0.05 पर एक महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चर डीएसफेरच डीएसजीएफपी इंजेक्शन न लगाना χ2 P
उद्भव दर 54.00% (27/50) बी 78.00% (39/50) ए 90.00% (45/50) ए 17.46 <.001
विकृति दर 51.85% (14/27) ए 0% (0/39) बी 0% (0/45) बी 49.84 <.001

तालिका 1: डीएसफेरहच, डीएसजीएफपी, या इंजेक्शन के बिना इंजेक्शन द्वारा इंजेक्ट ट्राइकोग्रामा डेनोलिमी का उद्भव और विकृति। विभिन्न लोअरकेस पत्र पी < 0.05 पर उद्भव दर में महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं। विभिन्न अपरकेस अक्षर P < 0.05 पर विकृति दर में महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं। तालिका में सूचीबद्ध χ2 और P के मूल्यों का अनुमान χ2 स्वतंत्र परीक्षण द्वारा लगाया जाता है और उद्भव दर और विकृति दर पर तीन उपचार स्तरों के कुल प्रभाव को इंगित करता है।

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Discussion

ट्राइकोग्रामा ततैया को प्रभावी जैविक नियंत्रण एजेंटों के रूप में मान्यता प्राप्त है, विशेष रूप से कृषि और वानिकी में लेपिडोप्टेरान कीटों की एक श्रृंखला को लक्षित करतेहैं। ये कम ततैया मेजबान अंडे के भीतर अपने अपरिपक्व चरणों से गुजरती हैं, एक विशेषता जो आरएनएआई प्रयोगों 5,18के संचालन में चुनौतियां प्रस्तुत करती है। यह अध्ययन टी. डेन्रोलिमी में आरएनएआई प्रयोगों के संचालन के लिए एक व्यापक दृश्य मार्गदर्शिका प्रदान करता है। ट्राइकोग्रामा प्रजातियों के बीच साझा जैविक लक्षणों को देखते हुए, प्रक्रिया को कुछ समायोजन के साथ अन्य ट्राइकोग्रामा प्रजातियों और एंडोपैरासिटिक प्रजातियों में आरएनएआई अध्ययन या सूक्ष्म इंजेक्शन के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।

प्रक्रिया कई नवीन दृष्टिकोणों का परिचय देती है, dsRNA सामग्री के कुशल सूक्ष्म इंजेक्शन की सुविधा, T. denrolimi के लिए RT-qPCR प्रक्रिया को सुव्यवस्थित करना, और प्रत्यारोपण का अनुकूलन करना और T. denrolimi pupae के इन विट्रो इनक्यूबेशन में। इस अध्ययन के अनुसार, प्रत्यारोपित प्यूपा की उद्भव दर बिना किसी इंजेक्शन के 90% तक पहुंच गई। जब प्रत्यारोपित प्यूपा को डीएसजीएफपी इंजेक्शन के अधीन किया गया था, तो इन प्यूपा की उद्भव दर 78% (तालिका 1) थी। ट्राइकोग्रामा में सफल आरएनएआई प्रयोग सटीक सूक्ष्म इंजेक्शन और इन विट्रो में प्यूपा के सावधानीपूर्वक इनक्यूबेशन पर काफी टिका है। इंजेक्शन के दौरान क्षति के लिए पृथक ट्राइकोग्रामा प्यूपा की संवेदनशीलता ओवरसाइज़्ड माइक्रो-इंजेक्शन सुइयों, जल्दबाजी में इंजेक्शन तकनीक, या अगर सब्सट्रेट पर माइक्रोबियल संदूषण के परिणामस्वरूप हो सकती है। यहां प्रस्तुत विस्तृत दृश्य विधि भी टी डेनोलिमी में माइक्रोइंजेक्शन तकनीक में अंतर्दृष्टि प्रदान करती है, जो न केवल अन्य आनुवंशिक संपादन उपकरण (जैसे, सीआरआईएसपीआर-कैस 9 सिस्टम) के लिए आवश्यक है, बल्कि विभिन्न शारीरिक प्रयोगों (जैसे, सहजीवन के कृत्रिम संक्रमण और शारीरिक प्रतिक्रियाओं के अवरोधकों या सक्रियकर्ताओं की डिलीवरी)1,14,15,16.

आरटी-क्यूपीसीआर विश्लेषण के लिए, इस अध्ययन में लगभग 1,500 प्यूपा इंजेक्ट किए गए थे। टी डेन्रोलिमी के छोटे आकार को देखते हुए, आरटी-क्यूपीसीआरविश्लेषण 9 के लिए पर्याप्त आरएनए गुणवत्ता और मात्रा सुनिश्चित करने के लिए प्रति प्रतिकृति न्यूनतम 100 प्यूपा आवश्यक है। नतीजतन, सैकड़ों प्यूपा में dsRNA इंजेक्ट करना अनिवार्य है। इसके अतिरिक्त, आरएनए अलगाव प्रक्रिया में सुधार (उदाहरण के लिए, एक विशिष्ट आरएनए निष्कर्षण किट को नियोजित करना, पीसीआर कार्यक्रमों को परिष्कृत करना) प्रति प्रतिकृति ट्राइकोग्रामा व्यक्तियों की कम संख्या से योग्य आरएनए सामग्री प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण में भिगोने या खिलाने के माध्यम से dsRNA की डिलीवरी शामिल है, जो dsRNA के अधीन पर्याप्त संख्या में व्यक्तियों को प्राप्त करने के लिए अधिक सुविधाजनक हो सकता है। इसके अतिरिक्त, यह ध्यान रखना आवश्यक है कि वर्तमान आरएनएआई प्रक्रिया केवल टी. डेन्रोलिमी के प्यूपा चरण में लागू होती है। भविष्य के अनुसंधान भ्रूण और लार्वा चरणों15,16 के लिए कुशल आरएनएआई तरीकों के विकास पर विशेष जोर देना चाहिए.

संक्षेप में, इस अध्ययन ने टी. डेन्रोलिमी में एक कुशल आरएनएआई विधि को चित्रित किया है। दशकों से, पूरे ट्राइकोग्रामा जीनस के भीतर जीन कार्यों का शायद ही कभी पता लगाया गया है। वर्तमान पद्धति ट्राइकोग्रामा ततैया में विकासात्मक और शारीरिक गतिविधियों के दौरान जीन नियमों की जांच के लिए एक मजबूत मॉडल प्रदान करती है। भविष्य के अनुसंधान को आनुवंशिक उपकरणों के विकास पर जोर देना चाहिए, जैसे कि जीनोम संपादन और ट्राइकोग्रामा ततैया में आरएनए हस्तक्षेप। ट्राइकोग्रामा ततैया के आणविक जीव विज्ञान की गहराई से अन्वेषण कीटों 8,9 के नियंत्रण के लिए इन जैविक नियंत्रण एजेंटों के बड़े पैमाने पर पालन दक्षता और क्षेत्र के प्रदर्शन में सुधार के लिए मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (32172476, 32102275), कृषि विज्ञान और प्रौद्योगिकी नवाचार कार्यक्रम (सीएएएस -ZDRW202203, सीएएएस -ZDRW202108), और स्थानीय विज्ञान और प्रौद्योगिकी विकास (XZ202301YD0042C) का मार्गदर्शन करने वाले केंद्रीय निधि की परियोजनाओं द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2x ES Taq MasterMix (Dye) Cowin Biotech, China CW0690H To amplify the dsRNA sequences
20x PBS Buffer, DEPC treated (7.2-7.6) Sangon Biotech, China B540627-0500 To dilute dsRNA
Agar strip Shishi Globe Agar Industries Co.,Ltd, China n/a To make culture medium
Ampicillin sodium Sangon Biotech, China A610028 To make culture medium
Bioer Constant temperature metal bath  BIOER, China MB-102 To synthesis dsRNA
Borosilicate glass capillary  WPI, USA 1B100-4 To pull capillary glass needle
Clean bench  Airtech, China SW-CJ-1FD To extract RNA
Double distilled water Sangon Biotech, China A500197-0500 To dilute cDNA
Environmental Testing chamber  Panasonic, Japan MLR-352H-PC To culture T. denrolimi
Eppendorf Centrifuge  Eppendrof, Germany 5418R To store RNA content
Eppendorf FemtoJet 4i Eppendrof, Germany FemtoJet 4i To inject T. denrolimi
Eppendorf Refrigerated Centrifuge  Eppendrof, Germany 5810R Centrifuge
Ethanol solution (75%, RNase-free) Aladdin, China M052131-500ml To extract RNA
Gel Extraction Kit Omega, USA D25000-02 To extract cDNA
GUM Arabic Solarbio, China CG5991-500g To make egg card
Isopropyl alchohol Aladdin, China 80109218 To extract RNA
Laser-Based Micropipette Puller  SUTTER, USA P-2000 To pull capillary glass needle
Microloader  Eppendrof, Germany 20 µL To load dsRNA
Multi-sample tissue grinder  LICHEN, China LC-TG-24 To grind T. denrolimi
Needle Grinder  SUTTER, USA BV-10-E To grind capillary glass needle
Nuclease-Free Water Sangon Biotech, China To dilute RNA
OLYMPUS Microscope OLYMPUS, Japan XZX16 To observe T. denrolimi
PCR machine  Bio-rad, USA S-1000 For DNA amplification
PowerPac Basic Bio-rad, USA PowerPacTM Basic To detect the quality of dsRNA 
Primer of dsGFP (Forward) [TAATACGACTCACTATAGGG]
ACAAACCAAGGCAAGTAATA
Primer of dsGFP (Reverse) [TAATACGACTCACTATAGGG]
CAGAGGCATCTTCAACG
Primer of Ferhch for qPCR (Forward) TGAAGAGATTCTGCGTTCTGCT
Primer of Ferhch for qPCR (Reverse) CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT
Primer of Ferhch for RNAi (Reverse) [TAATACGACTCACTATAGGG]AG
TAGCCATCATCTTTCC
Primer of Ferhch for RNAi(Forward) [TAATACGACTCACTATAGGG]
ACACTGTCAATCGTCCTG
Primer of FoxO for qPCR (Forward) CTACGCCGATCTCATAACGC
Primer of FoxO for qPCR (Reverse) TGCTGTCGCCCTTGTCCT
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) TaKaRa, Japan RR047A
Quantitative Real-time PCR  Bio-rad, USA CFX 96 Touch To perform reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) 
Real-time PCR (TaqMan) Primer and Probes Design Tool https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/
T7 RiBoMAX Express RNAi System Promega, USA P1700 To synthesis dsRNA  in vitro 
TB Green Premix Ex TaqTM Equation 1 (Til RnaseH Plus) TaKaRa, Japan RR820A To perform RT-qPCR
Trichloromethane KESHI, China GB/T682-2002 To extract RNA
TRIzol Reagent Ambion, USA 15596018 To extract total RNA content from samples
Ultra-low Temperature Freezer  Thermo, USA Forma 911

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References

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जीवविज्ञान अंक 201
अंडे परजीवी में आरएनए हस्तक्षेप, <em>ट्राइकोग्रामा डेंड्रोलिमी</em> मात्सुमुरा
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