Aufzucht von Axenic Delia antiqua mit halbfermentiertem sterilem Futter
Summary
Ein einfaches Verfahren zur Aufzucht axenischer Delia antiqua mit halbfermentiertem sterilem Futter wird beschrieben. Mittels PCR wurde nur ein Wolbachia-Stamm in jedem Instar von axenic D. antiqua nachgewiesen.
Abstract
Axenische Insekten werden aus sterilen künstlichen Aufzuchtsystemen mit sterilen Medien gewonnen. Diese Insekten, die sich durch ihre geringe Größe, ihren kurzen Wachstumszyklus und ihren geringen Futterbedarf auszeichnen, sind ideal, um die Beziehung zwischen Mikroorganismen und Wirten zu untersuchen. Die Darmmikrobiota beeinflusst maßgeblich die physiologischen Eigenschaften von Insektenwirten, und die Einführung spezifischer Stämme in axenische Insekten bietet eine Methode zur Überprüfung der mikrobiellen Funktionen des Darms. Delia antiqua, ein bedrohlicher Schädling aus der Ordnung der Diptera, der Familie Anthomyiidae und der Gattung Delia, ernährt sich hauptsächlich von Zwiebeln, Knoblauch, Lauch und anderen Gemüsesorten aus der Familie der Liliaceae. Seine Larven ernähren sich von den Zwiebeln, was zu Fäulnis, Welken und sogar zum Absterben ganzer Pflanzen führt. Durch die Aufzucht axenischer Larven können Folgestudien durchgeführt werden, um die Auswirkungen der Darmflora auf das Wachstum und die Entwicklung von D. antiqua zu beobachten. Im Gegensatz zu der Methode, bei der assoziierte Mikroben durch Antibiotika eliminiert werden, wird in diesem Artikel ein kostengünstiger und hocheffizienter Ansatz zur Aufzucht von axenischen D. antiqua vorgestellt. Nach der Oberflächensterilisation von D. antiqua-Eiern wurde halbfermentiertes, steriles Futter verwendet, um Larven aufzuziehen, und der axenische Zustand von D. antiqua wurde durch kulturabhängige und kulturunabhängige Assays verifiziert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Kombination aus Sterilisation von Insekteneiern und der Herstellung steriler Diäten für die Larvenzucht die Entwicklung einer effizienten und einfachen Methode zur Gewinnung von axenhaltigem D. antiqua ermöglicht hat. Diese Methode bietet einen leistungsstarken Ansatz zur Untersuchung von Insekten-Mikroflora-Interaktionen.
Introduction
Axenische Tiere, definiert als Tiere, bei denen keine lebensfähigen Mikroorganismen oder Parasiten nachgewiesen werden können, sind wertvolle experimentelle Modelle für die Untersuchung von Wirt-Mikroorganismen-Interaktionen 1,2. Insekten, die größte Gruppe der Wirbellosen, können symbiotische Beziehungen mit Mikroorganismen eingehen3. Axenische Insekten können verwendet werden, um Wirt-Symbionten-Interaktionen in symbiotischen Systemen zu untersuchen4. Zum Beispiel etablierten Nishide et al.5 ein praktisches steriles Aufzuchtverfahren für den übelriechenden Wurm Plautia stali, das eine zuverlässige und rigorose Analyse von Wirt-Symbionten-Interaktionen in symbiotischen Modellsystemen ermöglicht. Axenische Insekten können durch Sterilisation des Eistadiums und sterile Nahrung für die Larven und erwachsenen Tiere erzeugt werden 6,7. Axenische Insekten sind von großer Bedeutung und werden in der biologischen Forschung häufig eingesetzt. Zum Beispiel zeigte eine von Somerville et al.8 durchgeführte Studie, dass Diamantmotten, die mit Enterobacter cloacae geimpft wurden, die Anpassungsfähigkeit transgener Männchen verbesserten.
Delia antiqua Meigen ist weltweit ein wirtschaftlich bedeutender Schädling von Zwiebeln und anderen Liliengewächsen, wobei seine Larven die Zwiebeln von Zwiebeln und anderen Liliaceae-Kulturen schädigen9. D. antiqua kommt hauptsächlich in gemäßigten Klimazonen vor und ist in Zwiebelanbaugebieten Amerikas, Europas und Asiens weit verbreitet. Wenn es nicht richtig bekämpft wird, kann es zu Ernteverlusten bei Zwiebeln (Allium cepa L.), Knoblauch (Allium sativum L.), Schalotten (Allium fistulosum L.) und Lauch (Alliumchoenoprasum L.) von 50 % bis 100 % führen10,11. Die Larven ernähren sich von den unterirdischen Teilen der Pflanzen, und diese Fütterung führt dazu, dass die Sämlinge welken und schließlich sterben. Darüber hinaus können beschädigte Pflanzen das Eindringen von Krankheitserregern ermöglichen, was zur Fäulnis der Knollen führt12. Selbst wenn die Pflanzen nicht vollständig von den Larven verzehrt werden, machen die von ihnen verursachten Schäden die Zwiebelpflanzen unverkäuflich und führen zu wirtschaftlichen Verlusten.
Insekten sind eng mit der Darmmikrobiota verbunden, und die meisten Insektendärme enthalten eine Vielzahl symbiotischer Bakterien, die von den vom Wirt bereitgestellten Nährstoffen gedeihen13,14. Jing et al.15 zeigten, dass die primäre Funktion der symbiotischen Gemeinschaft im Darm darin besteht, essentielle Nährstoffe bereitzustellen, gefolgt von Funktionen, die mit der Verdauung und Entgiftung zusammenhängen. In bestimmten Fällen können Darmbakterien als mikrobielle Ressource für die Schädlingsbekämpfung dienen. Daher ist es wünschenswert, die Leistungen und spezifischen Funktionen der einzelnen Darmbakterien im Körper von D. antiqua zu untersuchen. Daher ist die Präparation axenischer Larven besonders wichtig, um die Wechselwirkungen zwischen bestimmten Bakterienstämmen und Insekten zu untersuchen16. Derzeit ist eine häufig verwendete Methode zur Eliminierung von Darminsekten die Verwendung einer Antibiotikakombination zur Ausrottung assoziierter Mikroben 17,18,19. Im Gegensatz zur alleinigen Verwendung von Antibiotika, die nur die Anzahl der Keime reduzieren können, ermöglicht die axenische Aufzucht von Insekten die Kontrolle über die Zusammensetzung und Menge der Mikroorganismen, was eine genauere Validierung der Funktionalität der Darmmikrobiota ermöglicht.
Daher wird in diesem Artikel ein Protokoll für die Vorbereitung und Aufzucht von axenischer D. antiqua vorgestellt. Axenic Larvenfutter wird durch Hochtemperatursterilisation von natürlichem Futter in Kombination mit halbfermentierten Lebensmitteln gewonnen. Die Eizellen werden nach einem experimentellen Protokoll sterilisiert, um axenische Eier zu erhalten, und schließlich werden axenische Larven aus den axenischen Eiern kultiviert. Das axenische Aufzuchtsystem wurde für das Experiment nur eine Generation lang durchgeführt. Dies wird die Untersuchung der Interaktion zwischen Insekten und Darmmikrobiota erleichtern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Insekten besitzen eine hochkomplexe Darmmikrobiota20,21, was den Einsatz von axenischen Insekten erforderlich macht, die mit spezifischen Darmmikrobiellen Stämmen geimpft wurden, um die Interaktionen zwischen Insekten und Mikroorganismen zu untersuchen. Die Präparation von axenischen Insekten ist für solche Forschungsvorhaben von entscheidender Bedeutung. Die antibiotische Behandlung ist eine Methode zur Beseitigung der Darmmikrobiota. Zum Beispiel fütterten …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (32272530), dem New Twenty Policies for University in Jinan Project (2021GXRC040), Major Scientific and Technological Innovation Projects in Shandong Province (2021TZXD002) und dem Science and Education Integration Project der Qilu University of Technology (2022PYI009, 2022PY016, 2022PT105) unterstützt.
Materials
| 0.22 μM filter bottle | Thermo Scientific | 450-0045 | |
| 0.22 μM Syringe Filter | Biosharp | BS-QT-011 | |
| 100-mesh sieve | Zhejiang Shangyu Jinding Standard Sieve Factory | No Catalog numbers | |
| 1x PBS solution | Solarbio | P1020 | |
| 2x Taq PCR Master Mix | GENVIEW | GR1113-1ML | |
| 5.2% NaClO solution | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80010428 | |
| 500 mL Conical flask | Thermo Scientific | 4103-0500 | |
| 50 mL vented centrifuge tube | JET BIOFIL | BRT-011-050 | |
| 50x TAE buffer | GENVIEW | GT1307 | |
| Agar powder | Ding Guo | DH010-1.1 | |
| Biochemical incubator | STIK | 21040121500010 | |
| Cell sieve | SAINING | 5022200 | |
| Choline chloride | Sangon Biotech | A600299-0100 | |
| ddH2O | Ding Guo | PER018-2 | |
| Disposable grinding pestle | JET BIOFIL | CSP-003-002 | |
| DNA extraction kit | Sangon Biotech | B518221-0050 | |
| DNA Marker | Sangon Biotech | B600335-0250 | |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10009218 | |
| Filter paper | NEWSTAR | 1087309025 | |
| Food processor | Guangdong Midea Life Electric Appliance Manufacturing Co., Ltd. | WBL25B26 | |
| Illuminated incubator | Shanghai ESTABLISH Instrumentation Co., Ltd. | A16110768 | |
| L-Ascorbic acid | Sangon Biotech | A610021-0100 | |
| L-shaped spreader | SAINING | 6040000 | |
| Nutrient agar medium | Hope Bio | HB0109 | |
| Scissors | Bing Yu | BY-103 | Purchase on Jingdong |
| Shock incubator | Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd. | 2020000014 | |
| Sucrose | GENVIEW | CS326-500G | |
| Super Green nucleic acid dye | Biosharp | BS355A | |
| Super-clean table | Heal Force | AC130052 | |
| TSB | Hope Bio | HB4114 | |
| Vacuum pump | Zhejiang Taizhou Seeking Precision Vacuum Pump Co., Ltd. | 22051031 | |
| Yeast extract | Thermo Scientific | LP0021B |
Riferimenti
- Al-Asmakh, M., Zadjali, F. Use of germ-free animal models in microbiota-related research. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (10), 1583-1588 (2015).
- Bhattarai, Y., Kashyap, P. C. Germ-free mice model for studying host-microbial interactions. Methods in Molecular Biology. 1438, 123-135 (2016).
- Douglas, A. E. Multiorganismal insects: diversity and function of resident microorganisms. Annual Review of Entomology. 60 (1), 17-34 (2015).
- Wang, G. -. H., Brucker, R. M. An optimized method for Nasonia germ-free rearing. Scientific Reports. 12 (1), 219 (2022).
- Nishide, Y., et al. Aseptic rearing procedure for the stinkbug Plautia stali (Hemiptera: Pentatomidae) by sterilizing food-derived bacterial contaminants. Applied Entomology and Zoology. 52 (3), 407-415 (2017).
- Ma, M., Liu, P., Yu, J., Han, R., Xu, L. Preparing and rearing axenic insects with tissue cultured seedlings for host-gut microbiota interaction studies of the leaf beetle. Journal of Visualized Experiments. 176, e63195 (2021).
- Zhu, Z., Wang, D., Liu, Y., Tang, T., Wang, G. H. Optimizing the rearing procedure of germ-free wasps. Journal of Visualized Experiments. 197, e65292 (2023).
- Somerville, J., Zhou, L. Q., Raymond, B. Aseptic rearing and infection with gut bacteria improve the fitness of transgenic diamondback moth, Plutella xylostella. Insects. 10 (4), 89 (2019).
- Shuoying, N., Jiufeng, W., Jinian, F., Hugo, R. Predicting the current potential and future world wide distribution of the onion maggot, Delia antiqua using maximum entropy ecological niche modeling. PLoS ONE. 12 (2), e0171190 (2017).
- Ellis, P. R., Eckenrode, C. J. Factors influencing resistance in Allium sp. to onion maggot. Bulletin of the Entomological Society of America. 25 (2), 151-154 (1979).
- Nault, B. A., Straub, R. W., Taylor, A. G. Performance of novel insecticide seed treatments for managing onion maggot (Diptera : Anthomyiidae) in onion fields. Crop Protection. 25 (1), 58-65 (2006).
- Leach, A., Reiners, S., Fuchs, M., Nault, B. Evaluating integrated pest management tactics for onion thrips and pathogens they transmit to onion. Agriculture Ecosystems & Environment. 250, 89-101 (2017).
- Zhou, F., et al. Bacterial Inhibition on Beauveria bassiana Contributes to Microbiota Stability in Delia antiqua. Frontiers in Microbiology. 12, 710800 (2021).
- Zhou, F., et al. Symbiotic bacterium-derived organic acids protect delia antiqua larvae from entomopathogenic fungal infection. mSystems. 5 (6), 00778-00820 (2020).
- Jing, T. Z., Qi, F. H., Wang, Z. Y. Most dominant roles of insect gut bacteria: digestion, detoxification, or essential nutrient provision. Microbiome. 8 (1), 38 (2020).
- Kietz, C., Pollari, V., Meinander, A. Generating germ-free drosophila to study gut-microbe interactions: protocol to rear Drosophila under axenic conditions. Current Protocols in Toxicology. 77 (1), e52 (2018).
- Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402 (2018).
- Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12974-12979 (2004).
- Romoli, O., Schonbeck, J. C., Hapfelmeier, S., Gendrin, M. Production of germ-free mosquitoes via transient colonisation allows stage-specific investigation of host-microbiota interactions. Nature Communications. 12 (1), 942 (2021).
- Ma, M., et al. Metabolic and immunological effects of gut microbiota in leaf beetles at the local and systemic levels. Integrative Zoology. 16 (3), 313-323 (2021).
- Zhang, W., et al. Differences between microbial communities of pinus species having differing level of resistance to the pine wood nematode. Microbial Ecology. 84 (4), 1245-1255 (2022).
- Jung, S., Kim, Y. Synergistic effect of Xenorhabdus nematophila K1 and Bacillus thuringiensis subsp aizawai against Spodoptera exigua (Lepidoptera : Noctuidae). Biological Control. 39 (2), 201-209 (2006).
- Raymond, B., et al. A mid-gut microbiota is not required for the pathogenicity of Bacillus thuringiensis to diamondback moth larvae. Environmental Microbiology. 11 (10), 2556-2563 (2009).
- Weersma, R. K., Zhernakova, A., Fu, J. Y. Interaction between drugs and the gut microbiome. Gut. 69 (8), 1510-1519 (2020).
- Llop, P., Latorre, A., Moya, A. Experimental epidemiology of antibiotic resistance: looking for an appropriate animal model system. Microbiology Spectrum. 6 (1), (2018).
- Doll, J. P., Trexler, P. C., Reynolds, L. I., Bernard, G. R. The use of peracetic acid to obtain germfree invertebrate eggs for gnotobiotic studies. American Midland Naturalist. 6 (1), 239 (1963).
- Dillon, R., Charnley, K. Mutualism between the desert locust Schistocerca gregaria and its gut microbiota. Research in Microbiology. 153 (8), 503-509 (2002).
- Tegtmeier, D., Thompson, C. L., Schauer, C., Brune, A. Oxygen affects gut bacterial colonization and metabolic activities in a gnotobiotic cockroach model. Applied and Environmental Microbiology. 82 (4), 1080-1089 (2016).
- Muhammad, A., Habineza, P., Hou, Y. M., Shi, Z. H. Preparation of red palm weevil Rhynchophorus Ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) germ-free larvae for host-gut microbes interaction studies. Bio-Protocol. 9 (24), e3456 (2019).
- Bavani, M. M., et al. Sterilization of Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae) Eggs for maggot debridement therapy. Journal of Medical Entomology. 59 (3), 1076-1080 (2022).
- Han, L. Z., Li, S. B., Liu, P. L., Peng, Y. F., Hou, M. L. New artificial diet for continuous rearing of Chilo suppressalis (Lepidoptera: Crambidae). Annals of the Entomological Society of America. 105 (2), 253-258 (2012).
- Bezerra, C. E. S., Amaral, B. B., Souza, B. Rearing Chrysoperla externa larvae on artificial diets. Neotropical Entomology. 46 (1), 93-99 (2017).
- Feng, H. Q., Jin, Y. L., Li, G. P., Feng, H. Y. Establishment of an artificial diet for successive rearing of Apolygus lucorum (Hemiptera: Miridae). Journal of Economic Entomology. 105 (6), 1921-1928 (2012).
- Hassan, B., Siddiqui, J. A., Xu, Y. J. Vertically transmitted gut bacteria and nutrition influence the immunity and fitness of Bactrocera dorsalis larvae. Frontiers in Microbiology. 11, 596352 (2020).
- Li, X. Y., et al. Dynamics of the intestinal bacterial community in black soldier fly larval guts and its influence on insect growth and development. Insect Science. 30 (4), 947-963 (2023).
- Moran, N. A., McCutcheon, J. P., Nakabachi, A. Genomics and Evolution of heritable bacterial symbionts. Annual Review of Genetics. 42, 165-190 (2008).
- Weinert, L. A., Araujo-Jnr, E. V., Ahmed, M. Z., Welch, J. J. The incidence of bacterial endosymbionts in terrestrial arthropods. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 282 (1807), 20150249 (2015).
- Weeks, A. R., Turelli, M., Harcombe, W. R., Reynolds, K. T., Hoffmann, A. A. From parasite to mutualist: Rapid evolution of Wolbachia in natural populations of Drosophila. PLOS Biology. 5 (5), 997-1005 (2007).
