Test di aspirazione con micropipetta a fluorescenza per studiare il meccanorilevamento dei globuli rossi

Sommario

L'esplorazione del comportamento cellulare sotto stress meccanico è fondamentale per i progressi della meccanica cellulare e della meccanobiologia. Introduciamo la tecnica di aspirazione a fluorescenza con micropipette (fMPA), un nuovo metodo che combina la stimolazione meccanica controllata con l'analisi completa della segnalazione intracellulare nelle singole cellule. Questa tecnica indaga nuovi studi approfonditi sulla meccanobiologia delle cellule vive.

Abstract

I saggi di aspirazione con micropipette sono stati a lungo una pietra miliare per lo studio della meccanica delle cellule vive, offrendo approfondimenti sulle risposte cellulari allo stress meccanico. Questo documento descrive in dettaglio un adattamento innovativo del test di aspirazione con micropipette accoppiate a fluorescenza (fMPA). Il saggio fMPA introduce la capacità di somministrare forze meccaniche precise monitorando contemporaneamente i processi di meccanotrasduzione delle cellule vive mediati dai canali ionici. La sofisticata configurazione incorpora una micropipetta in vetro borosilicato di precisione collegata a un serbatoio d'acqua finemente regolato e a un sistema di aspirazione pneumatica, facilitando l'applicazione a pressione controllata con incrementi fino ± 1 mmHg. Un miglioramento significativo è l'integrazione dell'imaging a epifluorescenza, che consente l'osservazione e la quantificazione simultanee dei cambiamenti morfologici cellulari e dei flussi intracellulari di calcio durante l'aspirazione. Il test fMPA, attraverso la sua combinazione sinergica di imaging a epifluorescenza con aspirazione di micropipette, stabilisce un nuovo standard per lo studio del meccanorilevamento cellulare in ambienti meccanicamente difficili. Questo approccio poliedrico è adattabile a varie configurazioni sperimentali, fornendo informazioni critiche sui meccanismi di meccanorilevamento a singola cellula.

Introduzione

Le scoperte in corso nel mondo dei comportamenti cellulari hanno accentuato il ruolo degli stimoli meccanici, come la tensione, lo sforzo di taglio dei fluidi, la compressione e la rigidità del substrato, nel dettare le attività cellulari dinamiche come l'adesione, la migrazione e la differenziazione. Questi aspetti meccanobiologici sono di fondamentale importanza per chiarire come le cellule interagiscono e rispondono al loro ambiente fisiologico, influenzando vari processi biologici ^1,2.

Nell'ultimo decennio, i saggi di aspirazione basati su micropipette si sono distinti come uno ....

Protocollo

Questo protocollo segue le linee guida ed è stato approvato dal Comitato Etico per la Ricerca Umana dell'Università di Sydney. Il consenso informato è stato ottenuto dai donatori per questo studio.

1. Isolamento dei globuli rossi umani

NOTA: La fase 1.1 deve essere eseguita da un flebotomo addestrato utilizzando un protocollo approvato dall'Institutional Review Board.

1. Prelevare 5 ml di sangue dalla vena cubitale mediana utilizzando un ago a farfalla da 19 G.
2. Trasferire il sangue raccolto in una provetta da 15 mL contenente enoxaparina 1:200 per prevenire la coagulazione.
....

Risultati

Per stabilire i saggi di aspirazione con micropipette, abbiamo prima costruito una camera cellulare personalizzata composta da due quadrati di metallo (rame/alluminio) collegati da una maniglia. Sono stati apposti due vetrini coprioggetti di terzo taglio (40 mm × 7 mm × 0,17 mm) per creare una camera riempita con 200 μL di globuli rossi sospesi nel tampone di Tyrode. Dopo aver introdotto i globuli rossi nella camera, una micropipetta in borosilicato su misura è stata fissata su un supporto e posizionata con cura all'inte.......

Discussione

I saggi di aspirazione con micropipette incarnano una metodologia raffinata, che impiega una sostanziale modulazione della pressione, un'esatta orchestrazione spaziale e un discernimento temporale affidabile per sondare le profonde complessità della biomeccanica cellulare. Questo studio pone particolare enfasi sull'applicazione della fMPA come strumento cruciale per svelare le risposte meccanosensibili sfumate mostrate dai globuli rossi sotto stimoli variabili. L'uso simultaneo di segnali in campo chiaro e fluorescenza h.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
µ Manager	Micro-Manager		Versione 2.0.0
Siringa da 1 mL	Terumo	210320D	Collabora con il Microfil
200 µ L Pipetta	Eppendorf	3123000055	Preparazione cella clood rossa
22 x 40 mm Vetrini	Knittel Glass	MS0014	Assemblaggio camera cellulare
Siringa da 50 mL	Terumo	220617E	Collegare alla torre dell'acqua
Cloruro di calcio (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C1016	Preparazione del tampone di Tryode - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,137 M NaCl, 2,7 mM KCl e 5,5 mM D-glucosio integrati con 1 mM di CaCl2. pH finale = 7,2
Centrifuga 5425	Eppendorf	5405000280	Preparazione delle cellule rosse
Clexane	Sigma-Aldrich	1235820	Per prevenire la coagulazione del sangue raccolto. 10.000 U/mL
DAQami	Diligent
Fluorescenza sorgente luminosa	CoolLED	pE-300	Sistema hardware per l'aspirazione di micropipette
Capillare in vetro	Produzione
Preparazione	Sigma-Aldrich	G8270	Tryode's - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,137 M NaCl, 2,7 mM KCl e 5,5 mM D-glucosio integrati con 1 mM di CaCl2. pH finale = 7,2
Hepes	Thermo Fisher	15630080	Preparazione del tampone di Tryode - 12 mM di NaHCO3, 10 mM di HEPES, 0,137 M di NaCl, 2,7 mM di KCl e 5,5 mM di D-glucosio integrati con 1 mM di CaCl2. pH finale = 7,2
Telecamera GigE ad alta velocità	Manta	G-040B	Sistema hardware per aspirazione micropipette
Pinza a pressione ad alta velocità	Strumento	scientifico HSPC-2-SB	Cooperare con la pompa a pressione
Stadio della testa del morsetto a pressione ad alta velocità	Strumento scientifico	HSPC-2-SB	Collabora con la pompa a pressione
Imaris	Oxford Instruments
Microscopia invertita	Olimpo	Sistema hardware per aspirazione micropipette Olympus IX83
Microfil	Mondo Strumenti di Precisione	MF34G-5	34 G (67 mm di lunghezza) Analizza la bolla d'aria nella micropipetta tagliata e verifica l'apertura del puntale della pipetta
Estrattore per micropipette	Sutter instrument	P1000	Produzione di micropipette
Milli Q EQ 7000 Sistema di purificazione dell'acqua ultrapura	Merck Millipore	ZEQ7000T0C	Tampone carbonato/bicarbonato & Preparazione del tampone di Tryode
Microforgia per pipette	micropipetta	Narishige	MF-900
cloruro di potassio (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	Preparazione del tampone di Tryode - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,137 M NaCl, 2,7 mM KCl e 5,5 mM D-glucosio integrati con 1 mM di CaCl2. pH finale = 7,2
Pompa di pressione	Strumento scientifico	PV-PUMP	Induce una pressione controllata durante l'esperimento
Prime 95B Camera	Photometrics	Prime 95B sCMOS	Flourscent imaging
Unità remota a rotellare	Sensapex	uM-RM3	Pannello di controllo per la regolazione della posizione della micropipetta
Contatore di cellule portatile Scepter 3.0	Merck Millipore	PHCC340KIT	Contatore automatico di cellule
Bicarbonato di sodio (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761	Preparato tampone carbonato/bicarbonato - 2,65 g di NaHCO3 con 2,1 g di Na2CO3 in 250 mL di acqua Mili Q - pH finale = 8-9.
Carbonato di sodio (Na2CO3)	Sigma-Aldrich	S2127	Preparato tampone carbonato/bicarbonato - 2,65 g di NaHCO3 con 2,1 g di Na2CO3 in 250 mL di acqua Mili Q - pH finale = 8-9.
Cloruro di sodio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Preparazione del tampone Tryode  - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,137 M NaCl, 2,7 mM KCl e 5,5 mM D-glucosio integrati con 1 mM di CaCl2. pH finale = 7,2
Fosfato di sodio monobasico monoidrato (NaH2PO4 • H2O)	Sigma-Aldrich	S9638	Preparazione del tampone di Tryode - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,137 M NaCl, 2,7 mM KCl e 5,5 mM D-glucosio integrati con 1 mM di CaCl2. pH finale = 7,2
Unità di controllo touch screen	Sensapex	uM-TSC	Pannello di controllo per la regolazione della posizione della micropipetta
X secco Obiettivo	Olimpo	hardware per l'aspirazione di micropipette	Olympus 60x/0.70 LUCPlanFL

di micropipette Narishige G-1 del tampone Glucose La produceSistema