Modeling Ligands into Maps Derived from Electron Cryomicroscopy

Shaileshanand Jha; Sucharita Bose; Kutti R. Vinothkumar

doi:10.3791/66310

JoVE Journal > Biochemistry

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Biochimica

Modeling Ligands into Maps Derived from Electron Cryomicroscopy(전자 극저온 현미경에서 파생된 맵으로 리간드 모델링)

Published: July 19, 2024

doi:

10.3791/66310

Shaileshanand Jha*¹, Sucharita Bose*², Kutti R. Vinothkumar

¹National Centre for Biological Sciences,Tata Institute of Fundamental Research, ²Institute for Stem Cell Science and Regenerative Medicine

Summary

이 프로토콜은 거대분자의 CryoEM 맵에서 소분자 리간드를 모델링하는 데 사용할 수 있는 도구를 소개합니다.

Abstract

고분자 복합체에서 단백질-리간드 상호 작용을 해독하는 것은 분자 메커니즘, 근본적인 생물학적 과정 및 약물 개발을 이해하는 데 매우 중요합니다. 최근 몇 년 동안 극저온 시료 전자 현미경(cryoEM)은 거대분자의 구조를 측정하고 원자 분해능에 가까운 리간드 결합 모드를 조사하는 강력한 기술로 부상했습니다. CryoEM 맵에서 비단백질 분자를 식별하고 모델링하는 것은 관심 분자 전체의 이방성 분해능과 데이터에 내재된 노이즈로 인해 종종 어렵습니다. 이 기사에서 독자들은 현재 리간드 식별, 모델 구축 및 선택된 거대분자를 사용한 원자 좌표 미세화에 사용되는 다양한 소프트웨어와 방법을 소개합니다. 에놀라아제 효소로 예시된 바와 같이 리간드의 존재를 식별하는 가장 간단한 방법 중 하나는 리간드가 있는 경우와 없는 상태에서 얻어진 두 개의 맵을 빼는 것입니다. 리간드의 추가 밀도는 더 높은 임계값에서도 차이 맵에서 두드러질 수 있습니다. 대사성 글루타메이트 수용체 mGlu₅의 경우에서 볼 수 있듯이 이러한 간단한 차이 맵을 생성할 수 없는 경우가 있습니다. 최근에 도입된 Fo-Fc 생략 맵을 유도하는 방법은 리간드의 존재를 검증하고 입증하기 위한 도구 역할을 할 수 있습니다. 마지막으로, 잘 연구된 β-갈락토시다아제를 예로 들어 CryoEM 맵의 리간드 및 용매 분자 모델링에 대한 분리능의 효과를 분석하고 CryoEM이 약물 발견에 어떻게 사용될 수 있는지에 대한 전망을 제시합니다.

Introduction

세포는 무수한 화학 반응을 동시에 독립적으로 수행함으로써 기능을 수행하며, 각 화학 반응은 환경 신호에 대한 반응으로 생존과 적응성을 보장하기 위해 세심하게 조절됩니다. 이는 생체 분자, 특히 단백질이 다른 거대분자 및 소분자 또는 리간드와 함께 일시적이거나 안정적인 복합체를 형성할 수 있도록 하는 분자 인식에 의해 달성됩니다¹. 따라서 단백질-리간드 상호 작용은 단백질 발현 및 활성의 조절, 효소에 의한 기질 및 보조 인자의 인식, 세포가 신호를 인식하고 전달하는 방법을 포함하는 생물학의 모든 과정에 기본이 됩니다 ^1,2. 단백질-리간드 복합체의 동역학적, 열역학적, 구조적 특성을 더 잘 이해하면 리간드 상호작용의 분자적 기초를 밝히고 약물 상호작용 및 특이성을 최적화하여 합리적인 약물 설계를 촉진할 수 있습니다. 단백질-리간드 상호 작용을 연구하는 경제적이고 빠른 접근 방식은 다양한 범위의 작은 분자를 가상으로 스크리닝하고 이러한 리간드의 결합 모드와 친화도를 예측하여 표적 단백질에 대한 친화도를 예측하는 계산 방법인 분자 도킹을 사용하는 것입니다³. 그러나 X선 회절(XRD), 핵 자기 공명(NMR) 또는 전자 초저온 현미경(cryoEM)으로 측정된 고해상도 구조의 실험적 증거는 이러한 예측에 대한 필수 증거를 제공하고 주어진 표적에 대한 새롭고 더 효과적인 활성제 또는 억제제의 개발을 지원합니다. 이 기사에서는 일반적으로 언급되는 기술인 ‘cryoEM’이라는 약어를 사용합니다. 그러나 올바른 명명법을 선택하는 것에 대한 논쟁이 진행 중이며, 최근에는 샘플이 극저온 온도에 있고 전자로 이미징되었음을 나타내기 위해 cryogenic-sample Electron Microscopy(cryoEM)라는 용어가 제안되었습니다⁴. 마찬가지로 CryoEM에서 파생된 맵은 전자 전위, 정전기 전위 또는 쿨롱 전위라고 하며 단순화를 위해 여기서는 CryoEM 맵 5,6,7,8,9,10을 사용합니다.

XRD는 단백질-리간드 복합체의 고분해능 구조 측정에서 황금 표준 기술이었지만, 지난 몇 년 동안 전자 현미경 데이터베이스(EMDB)^12,13에 기탁된 쿨롱 전위 맵 또는 cryoEM 맵의 급증에서 알 수 있듯이 분해능 혁명^{이후 11} cryoEM이 추진력을 얻었습니다 ¹⁴. 시료 전처리, 이미징 및 데이터 처리 방법의 발전으로 인해 2010년에서 2020년 사이에 CryoEM을 사용하는 PDB(Protein Data Bank)¹⁴ 증착의 수가 0.7%에서 17%로 증가했으며, 2020년에 보고된 구조의 약 50%가 3.5 Å 해상도 또는 그 이상의 해상도에서 측정되었습니다^15,16. CryoEM은 유연하고 비결정성 생물학적 거대분자, 특히 막 단백질 및 다중 단백질 복합체를 거의 원자 분해능으로 연구할 수 있게 해주어 결정화 과정을 극복하고 XRD에 의한 고해상도 구조 측정에 필요한 회절이 잘 되는 결정을 얻을 수 있기 때문에 제약 산업을 포함한 구조 생물학 커뮤니티에서 빠르게 채택되고 있습니다.

CryoEM 맵에서 리간드를 정확하게 모델링하는 것은 분자 수준에서 단백질-리간드 복합체의 청사진 역할을 하기 때문에 매우 중요합니다. 리간드를 전자 밀도^17,18,19,20에 맞추거나 구축하기 위해 리간드 밀도의 모양과 토폴로지에 의존하는 X선 결정학에 사용되는 몇 가지 자동화된 리간드 구축 도구가 있습니다. 그럼에도 불구하고, 해상도가 3 Å보다 낮으면, 이러한 접근법은 인식 및 구축을 위해 의존하는 위상학적 특징이 덜 정의되기 때문에 바람직하지 않은 결과를 생성하는 경향이 있습니다. 많은 경우에, 이러한 방법은 리간드를 CryoEM 맵으로 정확하게 모델링하는 데 효과적이지 않은 것으로 입증되었는데, 이는 이러한 맵이 일반적으로 3.5 Å-5 Å¹⁷ 사이의 중저 분해능 범위에서 결정되었기 때문입니다.

CryoEM에 의한 단백질-리간드 복합체의 3D 구조 측정의 첫 번째 단계는 리간드를 단백질과 함께 공동 정제하거나(리간드가 단백질에 대한 결합 친화도가 높은 경우) 그리드 준비 전에 특정 기간 동안 단백질 용액을 리간드로 배양하는 것입니다. 그 후, 소량의 시료를 플라즈마로 세척된 구멍이 있는 TEM 그리드에 배치한 다음 액체 에탄에서 급속 동결하고 최종적으로 cryo-TEM으로 이미징합니다. 수십만 개에서 수백만 개의 개별 입자에서 얻은 2D 투영 이미지를 평균화하여 거대분자의 3차원(3D) 쿨롱 전위 맵을 재구성합니다. 이러한 맵에서 리간드와 용매 분자를 식별하고 모델링하는 것은 맵 전체의 이방성 분해능(즉, 분리능이 거대분자 전체에서 균일하지 않음), 리간드가 결합된 영역의 유연성 및 데이터의 노이즈로 인해 많은 경우에 심각한 문제를 제기합니다. XRD를 위해 개발된 많은 모델링, 개선 및 시각화 도구는 현재 동일한 목적으로 CryoEM에서 사용하도록 조정되고 있습니다 18,19,20,21. 이 기사에서는 현재 리간드를 식별하고, 모델을 구축하고, CryoEM에서 파생된 좌표를 미세 조정하는 데 사용되는 다양한 방법과 소프트웨어에 대한 개요를 제공합니다. 다양한 해상도와 복잡성을 가진 특정 단백질-리간드 복합체를 사용하여 리간드를 모델링하는 데 관련된 프로세스를 설명하기 위해 단계별 프로토콜이 제공되었습니다.

CryoEM 맵에서 리간드를 모델링하는 첫 번째 단계에는 맵에서 리간드 밀도(비단백질)를 식별하는 것이 포함됩니다. 리간드 결합이 단백질의 구조적 변화를 유발하지 않는 경우, 단백질-리간드 복합체와 apo-단백질 사이의 간단한 차이 맵을 계산하면 기본적으로 추가 밀도 영역이 강조되어 리간드의 존재를 암시합니다. 이러한 차이는 두 개의 맵만 필요하기 때문에 즉시 관찰할 수 있으며, 3D 정제 과정에서 중간 맵도 사용하여 리간드가 있는지 확인할 수 있습니다. 또한 분해능이 충분히 높으면(<3.0 Å) 차이 맵은 물 분자의 위치뿐만 아니라 리간드 및 단백질 잔류물과 상호 작용하는 이온에 대한 통찰력을 제공할 수도 있습니다.

apo-protein map이 없는 경우, 이제 독립형 도구로 사용할 수 있고 Refmac 개선의 일부로 CCP-EM 소프트웨어 제품군^23,24에 통합되었으며 CCP4 8.0 릴리스 ^25,26에서도 Servalcat²²를 사용할 수 있습니다. Servalcat을 사용하면 날카롭지 않은 half-map과 apoprotein 모델을 입력으로 사용하여 FSC 가중 차이(Fo-Fc) 맵을 계산할 수 있습니다. Fo-Fc 생략 맵은 실험 맵(Fo)과 모델에서 파생된 맵(Fc) 간의 차이를 나타냅니다. 모델에 리간드가 없는 경우, 실험적 EM 맵과 겹치는 Fo-Fc 맵의 양성 밀도는 일반적으로 리간드의 존재를 암시합니다. 여기서 가정은 단백질 사슬이 맵에 잘 맞고 나머지 양의 밀도가 리간드의 위치를 나타낸다는 것입니다. 그러나 양의 밀도가 단백질 곁사슬의 잘못된 로타머와 같은 모델링 부정확성에서 비롯된 것인지 여부를 꼼꼼하게 조사하는 것이 중요합니다.

두 번째 단계는 사용 가능한 화학 정보에서 잘 정의된 형상을 가진 리간드의 데카르트 좌표 파일을 얻거나 만드는 것입니다. CCP4 단량체 라이브러리에서 이미 사용할 수 있는 표준 리간드(예: ATP 및 NADP⁺)는 단량체 접근 코드를 통해 좌표 및 형상 파일을 검색하여 미세화에 사용할 수 있습니다. 그러나 알려지지 않았거나 비표준 리간드의 경우 다양한 도구를 사용하여 형상 파일을 생성할 수 있습니다. 일부 예로는 Phenix²⁸의 eLBOW²⁷ – (전자 리간드 빌더 및 최적화 워크벤치), Lidia – Coot²⁹의 내장 도구, JLigand/ACEDRG^30,31, CCP-EM^23,24, Schrodinger 제품군 내 Glide의 Ligprep^32-a 모듈이 있습니다. 그런 다음 리간드 좌표 파일은 실험용 cryoEM 맵과 Coot의 차이 맵에 의해 안내되는 밀도에 맞춰집니다. 그 다음에는 Phoenix²⁸의 실제 공간 미세 조정 또는 Refmac³³의 상호 미세 조정이 이어집니다. 좋은 그래픽 카드와 위에서 언급한 소프트웨어가 장착된 Linux 워크스테이션 또는 랩톱이 필요합니다. 이러한 프로그램의 대부분은 다양한 제품군에 포함되어 있습니다. CCP-EM²⁴및 Phoenix²⁸은 교육용 사용자가 무료로 사용할 수 있으며 Coot, Refmac5 ^33,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine 등 이 기사에서 사용되는 다양한 도구가 포함되어 있습니다. 마찬가지로 Chimera³⁷ 및 ChimeraX³⁸은 교육용 사용자에게 무료 라이선스를 제공합니다.

Protocol

1. Mycobacterium tuberculosis의 에놀라아제에서 포스포에놀피루베이트(PEP) 모델링 PEP-enolase 복합체의 CryoEM 맵에서 리간드 밀도 식별EMDB의 추가 데이터에서 apo-enolase의 선명하지 않은 하프 맵(emd_30988_additional_1.map 및 emd_30988_additional_2.map)을 다운로드합니다( 재료 표 참조). ChimeraX를 엽니다( 재료 표 참조). 도구 모음에서 열기 ?…

Representative Results

예제 1결핵균(M. tuberculosis)의 효소 에놀라아제는 해당작용의 끝에서 두 번째 단계를 촉매하고 2-포스포글리세레이트를 여러 대사 경로에 필수적인 중간체인 포스포에놀피루베이트(PEP)로 전환합니다44,45. apo-enolase 및 PEP-bound enolase 샘플에 대한 CryoEM 데이터는 1.07 Å의 동일한 픽셀 크기에서 수집되었으며 이미지 처리는 Relion 3.1<sup cla…

Discussion

현미경 하드웨어 및 소프트웨어의 개선으로 최근 몇 년 동안 CryoEM 구조의 수가 증가했습니다. 단일 입자 cryoEM에서 현재 달성된 최고 분해능은 1.2 Å 57,58,59이지만 대부분의 구조는 약 3-4 Å 분해능으로 결정되고 있습니다. 중해상도에서 저해상도 맵의 리간드를 모델링하는 것은 까다로울 수 있으며 종종 모호성이 발생할 수 있?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

SJ는 DAE-TIFR로부터 박사 과정 학생을 받았으며 자금 지원이 인정됩니다. KRV는 DBT B-Life 보조금 DBT/PR12422/MED/31/287/2014 및 프로젝트 식별 번호에 따라 인도 정부 원자력부의 지원을 인정합니다. RTI4006.

Materials

CCP4-8.0	Consortium of several institutes	https://www.ccp4.ac.uk	Free for academic users and includes Coot and list of tools developed for X-ray crystallography
CCP-EM	Consortium of several institutes	https://www.ccpem.ac.uk/download.php	Free for academic users and includes Coot, Relion and many others
Coot	Paul Emsley, LMB, Cambridge	https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/	General software for model building but also available with other suites described above
DockinMap (Phenix)	Consortium of several institutes	https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html	Software inside the Phenix suite for docking model into cryoEM maps
Electron Microscopy Data Bank	Consortium of several institutes	https://www.ebi.ac.uk/emdb/	Public Repository for Electron Microscopy maps
Falcon	Thermo Fisher Scientific	https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf	Commercial, camera from Thermo Fisher
Phenix	Consortium of several institutes	https://phenix-online.org/download	Free for academic users and includes Coot
Protein Data Bank	Consortium of several institutes	https://rcsb.org	Public database of macromolecular structures
Pymol	Schrodinger	https://pymol.org/2/	Molecular viusalization tool. Educational version is free but comes with limitation. The full version can be obtained with a small fee.
Relion	MRC-LMB, Cambridge	https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html	Software for cryoEM image processing, also available with CCP-EM
Titan Krios	Thermo Fisher Scientific	https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c& gad_source=1&gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA AkZesWC4FYQSwIQRk ZApkj08MfYG040DtiiuL8 RihoCebEQAvD_BwE	Commercial, cryoTEM from Thermo Fisher
UCSF Chimera	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html	General purpose software for display, analysis and more
UCSF Chimera X	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/	General purpose software for display, analysis and more

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