Il presente protocollo descrive saggi di infezione per interrogare l'aderenza, l'invasione e la replicazione intracellulare di Shigella utilizzando linee cellulari epiteliali in vitro .
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Articolo metodologico
Analisi delle infezioni delle cellule epiteliali con Shigella
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il patogeno batterico enterico adattato all'uomo Shigella causa milioni di infezioni ogni anno, crea effetti di crescita a lungo termine tra i pazienti pediatrici ed è una delle principali cause di decessi per diarrea in tutto il mondo. L'infezione induce diarrea acquosa o sanguinolenta a causa dell'agente patogeno che transita nel tratto gastrointestinale e infetta le cellule epiteliali che rivestono il colon. Con l'aumento sbalorditivo della resistenza agli antibiotici e l'attuale mancanza di vaccini approvati, i protocolli di ricerca standardizzati sono fondamentali per studiare questo formidabile agente patogeno. In questo articolo, vengono presentate metodologie per esaminare la patogenesi molecolare della Shigella utilizzando analisi in vitro dell'aderenza batterica, dell'invasione e della replicazione intracellulare nelle cellule epiteliali del colon. Prima delle analisi dell'infezione, il fenotipo di virulenza delle colonie di Shigella è stato verificato mediante l'assorbimento del colorante rosso Congo su piastre di agar. Durante la coltura batterica possono essere presi in considerazione anche terreni di laboratorio integrati per simulare le condizioni in vivo . Le cellule batteriche vengono quindi utilizzate in un protocollo standardizzato per infettare le cellule epiteliali del colon nelle piastre di coltura tissutale a una molteplicità stabilita di infezione con adattamenti per analizzare ogni fase dell'infezione. Per i saggi di aderenza, le cellule di Shigella vengono incubate con livelli di terreno ridotti per promuovere il contatto batterico con le cellule epiteliali. Sia per i saggi di invasione che per quelli di replicazione intracellulare, la gentamicina viene applicata per vari intervalli di tempo per eliminare i batteri extracellulari e consentire la valutazione dell'invasione e/o la quantificazione dei tassi di replicazione intracellulare. Tutti i protocolli di infezione enumerano i batteri aderenti, invasi e/o intracellulari diluendo in serie i lisati di cellule epiteliali infette e placcando le unità formanti colonie batteriche rispetto ai titoli infettivi sulle piastre di agar rosso del Congo. Insieme, questi protocolli consentono una caratterizzazione e un confronto indipendenti per ogni fase dell'infezione da Shigella delle cellule epiteliali per studiare con successo questo patogeno.
Introduzione
Le malattie diarroiche causate da patogeni batterici enterici rappresentano un onere significativo per la salute globale. Nel 2016, le malattie diarroiche sono state responsabili di 1,3 milioni di decessi in tutto il mondo e sono state la quarta causa di morte nei bambini di età inferiore ai cinque anni(1,2). Il patogeno batterico enterico Gram-negativo Shigella è l'agente eziologico della shigellosi, una delle principali cause di decessi per diarrea in tutto il mondo3. La shigellosi causa ogni anno una significativa morbilità e mortalità nei bambini dei paesi a basso e medio r....
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Protocollo
1. Preparazione di reagenti e materiali
NOTA: Tutti i volumi sono coerenti con un test che utilizza due piastre a 6 pozzetti.
- TSB mezzo: Aggiungere 0,5 L di acqua deionizzata (DI) a 15 g di brodo di soia triptico (TSB, vedi tabella dei materiali) e autoclave. Conservare a temperatura ambiente.
- Terreno di sali biliari (TSB + BS): Per preparare TSB contenente lo 0,4% (p/v) di sali biliari, risospendere 0,06 g di sali biliari (BS, vedere la tabella dei materiali) in 15 mL di TSB sterilizzato in autoclave. Sterilizzare con filtro utilizzando un filtro PES da 0,22 μm.
NOTA....
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Risultati
Sono stati eseguiti saggi di aderenza, invasione e replicazione intracellulare confrontando S. flexneri 2457T wild type (WT) con S. flexneri ΔVF (ΔVF), un mutante che si ipotizza regoli negativamente la virulenza della Shigella. Poiché la Shigella utilizza i sali biliari come segnale per regolare la virulenza 17,18,47, sono stati eseguiti esperimenti dopo la subcoltura batterica in terreni TSB e TSB integrato con lo 0,4% (p/v) di sali
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Discussione
Questo protocollo descrive una serie di tre saggi standardizzati per studiare l'aderenza, l'invasione e la replicazione intracellulare delle cellule epiteliali intestinali della Shigella. Sebbene questi metodi siano semplicemente versioni modificate dei classici saggi di gentamicina utilizzati per studiare l'invasione e la replicazione intracellulare di vari patogeni batterici all'interno delle cellule ospiti 49,50,51, è necessario applicare considerazioni speciali quando si
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Il supporto per gli autori include il Dipartimento di Pediatria del Massachusetts General Hospital, il premio 2022A009041 del Comitato esecutivo per il finanziamento del supporto provvisorio alla ricerca, il R21AI146405 di sovvenzione del National Institute of Allergy and Infectious Diseases e il National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases grant Nutrition Obesity Research Center di Harvard (NORCH) 2P30DK040561-26. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,22 μ m Filtro PES | Millipore-Sigma | SCGP00525 | Filtro sterile in polietersulfone per la sterilizzazione di terreni fino a 50 mL |
| Provette per coltura da 14 mL Provette | per coltura Corning | 352059 | 17 mm x 100 mm Provette in polipropilene con tappo |
| Provette coniche da 50 mL | Corning | 430829 | Provette da centrifuga a fondo conico in polipropilene trasparente da 50 mL con tappo a tenuta stagna |
| Piastre per coltura tissutale a 6 pozzetti | Corning | 3516 | Le piastre sono trattate per un fissaggio ottimale delle cellule |
| Sali biliari | Sigma-Aldrich | B8756 | Rapporto 1:1 tra colato e desossicolato |
| Colorante rosso Congo | Sigma-Aldrich | C6277 | Un colorante diazo anionico a base di benzidina, purezza >85% |
| Vetrino della camera di conteggio delle cellule Countess | Invitrogen | C10283 | Da utilizzare con il Countess Automated Cell Counter |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Un reagente organico altamente polare |
| Dulbecco' s Medium Eagle modificato (DMEM) | Gibco | 10569-010 | DMEM è integrato con glucosio elevato, piruvato di sodio, GlutaMAX e |
| siero fetale bovino rosso fenolo (FBS) | Sigma-Aldrich | F4135 | Gentamicina sterile inattivata termicamente |
| Sigma-Aldrich | G3632 | concentrazione stock è di 50 mg/mL | |
| HT-29 linea cellulare | ATCC | HTB-38 | Adenocarcinoma; colon-retto in origine |
| Pellicola di paraffina | Bemis | PM999 | Pellicola sigillante da laboratorio |
| Piastre di Petri | Thermo Fisher Scientific | FB0875713 | 100 mm x 15 mm Piastre di Petri per terreni solidi |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Thermo Fisher Scientific 10010049 | concentrazione 1x; pH 7,4 | |
| Select agar | Invitrogen | 30391023 | Una miscela di polisaccaridi estratti dalle pareti cellulari delle alghe rosse per produrre terreni di placcatura batterica |
| Palloni T75 | Corning | 430641U | Fiasche per coltura tissutale |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Un tensioattivo ed emulsionante non ionico comune |
| Colorante blu di tripano | Invitrogen | T10282 | Un colorante per rilevare le cellule morte in coltura tissutale; solo le cellule vive possono escludere il colorante |
| Tripsina-EDTA | Gibco | 25200-056 | Reagente per la dissociazione cellulare per il mantenimento della linea cellulare e il passaggio |
| Brodo di soia triptico (TSB) | Sigma-Aldrich | T8907 | Terreni di crescita batterica |
Riferimenti
- Karambizi, N. U., McMahan, C. S., Blue, C. N., Temesvari, L. A. Global estimated Disability-Adjusted Life-Years (DALYs) of diarrheal diseases: A systematic analysis of data from 28 years of the global burden of disease study. PloS one. 16 (10), e0259077(2021).
- WHO.
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Ristampe e permessi
