कच्चे मांस से कैम्पिलोबैक्टर एसपीपी का पता लगाना और अलगाव
Summary
कैम्पिलोबैक्टर दुनिया भर में बैक्टीरियल फूडबोर्न गैस्ट्रोएंटेराइटिस का प्रमुख कारण है। प्रतिष्ठानों द्वारा अपनी सुविधाओं में प्रसार को कम करने के उपायों को लागू करने के बावजूद, दूषित उत्पाद लगातार उपभोक्ताओं तक पहुंचते हैं। पिछले बारह वर्षों में विकसित तकनीक कच्चे मांस से कैम्पिलोबैक्टर एसपीपी को अलग करने और पता लगाने के लिए मौजूदा तरीकों की सीमाओं को संबोधित करती है।
Abstract
यह लेख कच्चे मीट से कैम्पिलोबैक्टर एसपीपी को अलग करने के लिए एक तेज़ लेकिन मजबूत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, विशेष रूप से कैम्पिलोबैक्टर जेजुनी और कैम्पिलोबैक्टर कोलाई पर ध्यान केंद्रित करता है। प्रोटोकॉल स्थापित तरीकों पर बनाता है, संयुक्त राज्य अमेरिका में खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) और अमेरिकी कृषि विभाग (यूएसडीए) जैसे नियामक निकायों द्वारा नियोजित प्रचलित तकनीकों के साथ-साथ अंतर्राष्ट्रीय मानकीकरण संगठन (आईएसओ) यूरोप में। इस प्रोटोकॉल के लिए केंद्रीय एक rinsate इकट्ठा कर रहा है, जो केंद्रित है और घोड़े के खून युक्त बोल्टन शोरबा मीडिया में resuspended है. यह माध्यम तनावग्रस्त कैम्पिलोबैक्टर कोशिकाओं की वसूली को सुविधाजनक बनाने और आवश्यक संवर्धन अवधि को 50% तक कम करने के लिए सिद्ध हुआ है। समृद्ध नमूनों को फिर ब्रुसेला प्लेटों पर नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली पर स्थानांतरित किया जाता है। विधि की संवेदनशीलता और विशिष्टता में सुधार करने के लिए, 0.45 माइक्रोन और 0.65 माइक्रोन ताकना आकार फिल्टर झिल्ली का मूल्यांकन किया गया था। डेटा विशिष्टता को प्रभावित किए बिना 0.45 माइक्रोन ताकना आकार की तुलना में 0.65 माइक्रोन ताकना आकार फिल्टर के साथ सेल वसूली में एक 29 गुना वृद्धि का पता चला. कैम्पिलोबैक्टर की अत्यधिक प्रेरक विशेषताएं कोशिकाओं को झिल्ली फिल्टर के माध्यम से अगर माध्यम की ओर सक्रिय रूप से स्थानांतरित करने की अनुमति देती हैं, जो शुद्ध कैम्पिलोबैक्टर कॉलोनियों के प्रभावी अलगाव को सक्षम बनाती हैं। प्रोटोकॉल में प्रजातियों के स्तर पर आइसोलेट्स की पहचान करने के लिए मल्टीप्लेक्स क्वांटिटेटिव रियल-टाइम पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (एमक्यूपीसीआर) परख शामिल है। यह आणविक तकनीक प्रजातियों की पहचान का एक विश्वसनीय और कुशल साधन प्रदान करती है। खुदरा मीट से जुड़े पिछले बारह वर्षों में की गई जांच ने वर्तमान संदर्भ विधियों की तुलना में स्वाभाविक रूप से दूषित मांस के नमूनों से कैम्पिलोबैक्टर की वसूली को बढ़ाने के लिए इस पद्धति की क्षमता का प्रदर्शन किया है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल कम तैयारी और प्रसंस्करण समय समेटे हुए है। नतीजतन, यह मांस से कैम्पिलोबैक्टर की कुशल वसूली के लिए एक आशाजनक विकल्प प्रस्तुत करता है। इसके अलावा, इस प्रक्रिया को डीएनए-आधारित तरीकों के साथ समेकित रूप से एकीकृत किया जा सकता है, जिससे व्यापक पूरे-जीनोम अनुक्रमण विश्लेषण के साथ-साथ सकारात्मक नमूनों की तेजी से जांच की सुविधा मिलती है।
Introduction
कैम्पिलोबैक्टर एसपीपी दुनिया भर में बैक्टीरियल फूडबोर्न गैस्ट्रोएंटेराइटिस का प्रमुख कारण है, जिसमें सालाना अनुमानित 800 मिलियन मामलेहैं। एक प्रमुख जूनोटिक जीवाणु के रूप में, कैम्पिलोबैक्टर स्वाभाविक रूप से जंगली पक्षियों, खेत जानवरों और पालतू जानवरों सहित जानवरों की एक विस्तृत श्रृंखला के जठरांत्र संबंधीमार्ग का उपनिवेश करता है। वध या खाद्य प्रसंस्करण के दौरान, कैम्पिलोबैक्टर एसपीपी अक्सर शवों या मांस उत्पादों को दूषित करते हैं3. कैम्पिलोबैक्टीरियोसिस आमतौर पर कच्चे पोल्ट्री रस द्वारा अधपके पोल्ट्री या अन्य खाद्य पदार्थों के क्रॉस-संदूषण की खपत से जुड़ाहोता है। यह गंभीर जटिलताओं का कारण बन सकता है, जैसे कि गुइलेन-बर्रे सिंड्रोम, प्रतिक्रियाशील गठिया, और इम्यूनोकॉम्प्रोमाइज्ड व्यक्तियों में सेप्टीसीमिया4. खाद्य स्रोतों, विशेष रूप से पोल्ट्री उत्पादों से कैम्पिलोबैक्टर का पता लगाना और अलग करना, सार्वजनिक स्वास्थ्य निगरानी, प्रकोप की जांच और जोखिम मूल्यांकन के लिए आवश्यक है।
पारंपरिक संस्कृति आधारित तरीकों कैम्पिलोबैक्टर का पता लगाने 5,6 के लिए पारंपरिक और मानक तरीके हैं. हालांकि, लंबे इनक्यूबेशन समय (48 घंटे या अधिक), कम संवेदनशीलता (50% तक) सहित कई सीमाएं हैं, और सभी उपभेदों के लिए समावेशी नहीं हैं (कुछ तनावग्रस्त कैम्पिलोबैक्टर कोशिकाएं मीडिया में अच्छी तरह से या बिल्कुल भी विकसित नहीं हो सकती हैं)7. ऐसे पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) के रूप में आणविक विधियों, संस्कृति आधारित तरीकों की तुलना में अधिक तेजी से और संवेदनशील हैं, लेकिन वेआगे लक्षण वर्णन 8,9 के लिए व्यवहार्य आइसोलेट्स प्रदान नहीं करते.
कैम्पिलोबैक्टर का पता लगाने के लिए प्रतिरक्षाविज्ञानी विधियां वैकल्पिक और पूरक तरीके हैं। ये तेजी से, सरल और बहुमुखी हैं, लेकिन क्रॉस-रिएक्टिविटी सहित कई सीमाएं भी हैं (कुछ एंटीबॉडी गैर-कैम्पिलोबैक्टर बैक्टीरिया या अन्य पदार्थों से बंध सकते हैं जो समान एंटीजन साझा करते हैं), कम विशिष्टता (कुछ एंटीबॉडी सभी कैम्पिलोबैक्टर उपभेदों या सीरोटाइप से बंध नहीं सकते हैं), और नमूना तैयार करने की आवश्यकताएं (प्रतिरक्षाविज्ञानी तरीकों को अक्सर एंटीबॉडी के बंधन को बढ़ाने के लिए हस्तक्षेप करने वाले पदार्थों को हटाने के लिए नमूनों के पूर्व-उपचार की आवश्यकता होती है)10का उपयोग कर सकते हैं
कैम्पिलोबैक्टर के जीनस के भीतर, सी. जेजुनी और सी. कोलाई अधिकांश मानव कैम्पिलोबैक्टर संक्रमण (क्रमशः 81% और 8.4%) का कारण बनते हैं)11. दोनों सर्पिल के आकार के, माइक्रोएरोफिलिक और थर्मोफिलिक बैक्टीरिया हैं जिनमें एकध्रुवीय फ्लैगेलम या द्विध्रुवी फ्लैगेला होता है। प्रत्येक ध्रुव पर एक फ्लैगेलम के रोटेशन को इसकी विशिष्ट कॉर्कस्क्रू गतिशीलता के लिए प्राथमिक ड्राइविंग बल और इसके रोगजनन के लिए महत्वपूर्ण माना जाता है क्योंकि यह जीवाणु को मेजबान जठरांत्र संबंधी मार्ग के चिपचिपे श्लेष्म के माध्यम से तैरने की अनुमति देता है। कैम्पिलोबैक्टर की गतिशीलता अपने केमोसेंसरी प्रणाली है कि कोशिकाओं अनुकूल वातावरण12,13 की ओर ले जाने के लिए अनुमति देता है द्वारा नियंत्रित किया जाता है. सेल आकृति विज्ञान और कैम्पिलोबैक्टर की शारीरिक विशेषताओं के आधार पर, कुछ अध्ययनों ने कैम्पिलोबैक्टर एसपीपी के अलगाव के लिए झिल्ली निस्पंदन का उपयोग किया है।
यह अध्ययन कच्चे मांस से सी. जेजुनी और सी. कोलाई के अलगाव और बाद में पता लगाने के लिए एक तेज़ और मजबूत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, जो मौजूदा तरीकों की कमियों पर काबू पाता है और कई फायदे प्रदान करता है। टेंटेटिव कॉलोनियों को कैंबिलोबैक्टर एसपीपी के रूप में पुष्टि की जा सकती है, विभिन्न तरीकों का उपयोग करके, जैसे माइक्रोस्कोपी, जैव रासायनिक परीक्षण (जैसे, उत्प्रेरक और ऑक्सीडेज गतिविधि परख), या आणविक तरीकों6. विधि एक मल्टीप्लेक्स रीयल-टाइम पीसीआर (एमक्यूपीसीआर) परख का उपयोग करके प्रजातियों के स्तर पर आइसोलेट्स की पहचान करती है जो सी. जेजुनी और सी. कोलाई के लिए अद्वितीय जीन को लक्षित करती है। यह विधि अपेक्षाकृत सस्ती, तेज़ और चयनात्मक है, जो इसे खाद्य प्रसंस्करण सुविधाओं, नैदानिक प्रयोगशालाओं और अनुसंधान प्रयोगशालाओं सहित विभिन्न सेटिंग्स में उपयोग के लिए उपयुक्त बनाती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल का महत्व
सी. जेजुनी और सी. कोलाई कैम्पिलोबैक्टर की दो प्रमुख प्रजातियां थीं जो पोल्ट्री22 और पशु यकृत23,24 में प्रचलित पाई गईं। इस अध्ययन में, चिकन भागों (पैर, पंख और जांघ), चिकन लीवर, और बीफ लीवर के मांस के नमूने अलग-अलग समय अवधि के दौरान और विभिन्न खुदरा स्टोर और निर्माताओं से कैम्पिलोबैक्टर एसपीपी के अलगाव के लिए बेतरतीब ढंग से एकत्र किए गए थे। 49 कुल कैम्पिलोबैक्टर उपभेदों में से अलग, 36 की पहचान सी जेजुनी के रूप में की गई थी और 13 सी कोलाई थे, जिसमें कोई अन्य कैम्पिलोबैक्टर प्रजाति नहीं मिली थी, जो अन्य रिपोर्टों के अनुरूप है25.
परख सर्पिल के आकार की कोशिका आकृति विज्ञान और कैम्पिलोबैक्टर एसपीपी की विशेषता कॉर्कस्क्रू जैसी गतिशीलता पर आधारित है। एक सरल, अभी तक प्रभावी, निष्क्रिय निस्पंदन तकनीक26,27 है कि अपने सर्पिल आकार सेल आकृति विज्ञान (लंबे, पतला, 0.2-0.9 0.5-5 माइक्रोन द्वारा) और मजबूत corkscrew गतिशीलता पृष्ठभूमि जीवों का एक मिश्रण से कैम्पिलोबैक्टर अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था का शोषण किया. कैम्पिलोबैक्टर की उच्च गतिशीलता ने कोशिकाओं को झिल्ली फिल्टर को पार करने और अगर माध्यम के भीतर पाए जाने वाले अनुकूल परिस्थितियों की ओर बढ़ने की अनुमति दी, जबकि मांस उत्पादों से अन्य पृष्ठभूमि सूक्ष्मजीव गुजरने में असमर्थ थे। यह विधि अपेक्षाकृत सस्ती, तेज़ और चयनात्मक है, जो इसे खाद्य प्रसंस्करण सुविधाओं, नैदानिक प्रयोगशालाओं और अनुसंधान प्रयोगशालाओं सहित विभिन्न सेटिंग्स में उपयोग के लिए उपयुक्त बनाती है।
एक अग्रणी लेख अक्सर उद्धृत कहा गया है कि 0.45 माइक्रोन फिल्टर इतनी अच्छी तरह से काम किया है कि 0.65 माइक्रोन28 मूल्यांकन नहीं किया गया था. इस वर्तमान अध्ययन के परिणाम 0.65 माइक्रोन ताकना आकार फिल्टर संवर्धन से बरामद कोशिकाओं की संख्या में एक 29 गुना वृद्धि हुई जिसके परिणामस्वरूप, 0.45 माइक्रोन ताकना आकार की तुलना में काफी बेहतर प्रदर्शन से संकेत मिलता है. यह महत्वपूर्ण है क्योंकि चयनित फिल्टर कम चयनात्मकता प्रदर्शित नहीं करते के रूप में पहले29 की सूचना दी. इसके अलावा, जैसा कि यह ज्ञात है कि फ़िल्टरिंग प्रत्यक्ष चढ़ाना30 की तुलना में बरामद कैम्पिलोबैक्टर की मात्रा को काफी कम कर देगा, इसलिए, छिद्र के आकार में वृद्धि सूक्ष्मजीव की वसूली में सुधार करती है, जो पहले से रिपोर्ट किए गए निष्कर्षों21के अनुरूप है। यह महत्वपूर्ण है क्योंकि फिल्टर को पार करने वाली सभी कोशिकाओं ने एक समान कैम्पिलोबैक्टर कॉलोनियों का गठन किया, यह दर्शाता है कि दोनों फिल्टर अन्य माइक्रोफ्लोरा और खाद्य कणों को गुजरने से रोकने के लिए पर्याप्त थे। इसके अतिरिक्त, एफएसआईएस फ़्लोचार्ट7 एंटीबायोटिक दवाओं वाले कैम्पी-सेफेक्स प्लेटों पर फिर से स्ट्रीकिंग आइसोलेट्स के कारण विस्तारित परिणाम उत्पादन की क्षमता को नोट करता है। इसके विपरीत, इस पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल, जो cefoperazone, cycloheximide, trimethoprim, और vancomycin के साथ निस्पंदन और चयनात्मक संवर्धन के उपयोग को जोड़ती है, को फिर से लकीर की आवश्यकता नहीं है।
नियोजित वर्तमान विधि वर्तमान एफएसआईएस नमूनाकरण और सत्यापन कार्यक्रमों17 के अनुरूप है। चूंकि कैम्पिलोबैक्टर संदूषण का स्तर कम हो सकता है (153 सीएफयू/450 ग्राम चिकन), कुल्ला को चार के कारक द्वारा नमूने को केंद्रित करने के लिए अपकेंद्रित्र किया जाता है, जिससे परख की संवेदनशीलता बढ़ जाती है। 4x के कारक द्वारा rinsate ध्यान केंद्रित करने के बाद, नमूने 48 घंटे के लिए समृद्ध और आणविक जांच प्रणाली (MDS) एफएसआईएस प्रयोगशालाओं (डेटा नहीं दिखाया गया) द्वारा नियोजित विधि को दोहराने के लिए जांच कर रहे हैं. विशेष रूप से, वर्णित विधि अभी तक 24 घंटे के भीतर सकारात्मक उपभेदों की पहचान करने में विफल रही है जो कि 48 घंटे संवर्धन (डेटा नहीं दिखाया गया) का उपयोग करके आणविक जांच प्रणाली द्वारा पता लगाया गया था। अंत में, इस प्रोटोकॉल का एक अतिरिक्त लाभ यह है कि यह बैक्टीरिया की प्रजातियों से संबंधित जानकारी प्रदान कर सकता है और पहचान सकता है कि कैम्पिलोबैक्टर C.coli, C. jejuni, या C. lari है, जबकि MLG 41.07 में अपनाया गया MDS केवल कैम्पिलोबैक्टर के लिए एक द्विआधारी सकारात्मक/नकारात्मक प्रतिक्रिया प्रदान कर सकता है।
महत्वपूर्ण कदम
कैम्पिलोबैक्टर अलगाव और पहचान के लिए प्रोटोकॉल सेंट्रीफ्यूजेशन, निस्पंदन और आणविक विश्लेषण के दौरान सटीकता की आवश्यकता होती है। सटीक कमजोर पड़ने, उचित इनक्यूबेशन की स्थिति, और qPCR परख शर्तों के लिए सावधानीपूर्वक पालन विश्वसनीय प्रजातियों की पहचान के लिए महत्वपूर्ण हैं।
एक microaerophilic जीवाणु के रूप में, कैम्पिलोबैक्टर बहुत नाजुक और विभिन्न पर्यावरणीय तनाव के प्रति संवेदनशील है और विकास 31,32,33 के लिए अद्वितीय तेज शर्तों की आवश्यकता है. आम तौर पर परिवहन और भंडारण की लंबी अवधि के दौर से गुजर रहे खाद्य नमूनों में, कई कैम्पिलोबैक्टर कोशिकाओं शायद एक निष्क्रिय या sublethal/घातक घायल राज्य34,35 में कर रहे हैं. इस प्रकार, तनावग्रस्त कोशिकाओं को उनके खाद्य मैट्रिक्स से पुनर्प्राप्त करना और उन्हें उच्च सांद्रता में विकसित करना महत्वपूर्ण है। प्रक्रिया के पहले चरण में, हमने भोजन से कैम्पिलोबैक्टर के चयनात्मक संवर्धन के लिए लेक्ड घोड़े के रक्त और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक बोल्टन शोरबा का उपयोग किया। ऐड-इन रक्त मुक्त ऑक्सीजन कणों के प्रतिकूल प्रभावों को दूर करने के लिए ऑक्सीजन शमनएजेंट के रूप में कार्य करता है। एंटीबायोटिक दवाओं पृष्ठभूमि माइक्रोफ्लोरा37 के विकास को रोकने के लिए इस्तेमाल किया गया.
परिवेशी वायुमंडलीय ऑक्सीजन के लिए कैम्पिलोबैक्टर के जोखिम समय को कम करने के लिए, कोशिकाओं को फिल्टर को पार करने की अनुमति देने के लिए 15 मिनट की इनक्यूबेशन अवधि का चयन किया गया था। इसके अलावा, फिल्टर के नीचे ब्रुसेला अगर प्लेट की नमी ने पारित होने की दर में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई। विशेष रूप से, 0 घंटे, 1 घंटे, 2 घंटे और 3 घंटे के लिए सूखे अगर प्लेटों के परीक्षण से परिणाम सुझाव दिया है कि फिल्टर में एक उच्च नमी सामग्री के माध्यम से गुजर से कोशिकाओं को रोका. समान रूप से महत्वपूर्ण प्लेटों और फिल्टर पर फिल्टर और बूंदों का सटीक स्थान है, दोनों कोशिकाओं को अलग करने की सफलता को प्रभावित करते हैं।
संभावित नुकसान और सीमाएं
अलग करने और कच्चे चिकन के नमूनों से कैम्पिलोबैक्टर प्रजातियों की पहचान के लिए एक संरचित दृष्टिकोण पेश करते हुए, इस प्रोटोकॉल की कई सीमाएं ध्यान देने योग्य हैं। बाहरी संदूषण, अपर्याप्त रूप से सूखी प्लेटें, माइक्रोबियल आंदोलन को बाधित करने वाले फिल्टर का दबाना, गोली के भीतर सूक्ष्मजीवों का फंसना, वायुमंडलीय कक्ष की अधूरी सीलिंग, और फिल्टर सीमाओं से परे फैलने वाली बूंदें प्राथमिक नुकसानों में से हैं।
खाद्य सतहों से सूक्ष्मजीवों का अपर्याप्त पृथक्करण या नमूने के थोक के भीतर उनका कारावास इस पद्धति का उपयोग करके उनके अलगाव में बाधा डाल सकता है। इसके अतिरिक्त, निष्क्रिय फिल्टर के माध्यम से ट्रैवर्सल के लिए माइक्रोबियल गतिशीलता पर भरोसा करना एक उल्लेखनीय सीमा प्रस्तुत करता है; यह संभव है कि फिल्टर झिल्ली कुछ कम गतिशील कैम्पिलोबैक्टर उपभेदों को बनाए रखा, के रूप में यह दिखाया गया है फिल्टर भोजन38 में माइक्रोबियल रोगजनकों की कब्जा दक्षता को कम कर सकते हैं. आगे की सीमाओं में सेंट्रीफ्यूजेशन और निस्पंदन प्रक्रियाओं की बैच प्रकृति, फिल्टर क्लॉगिंग के लिए संवेदनशीलता, और गठित गोली को फैलाने में अक्षमता शामिल है, जो माइक्रोबियल भार की सटीकता को प्रभावित करेगी। ये सीमाएं सामूहिक रूप से व्यापक विश्लेषण सुनिश्चित करने में सावधानी और पूरक पद्धतियों की आवश्यकता पर जोर देती हैं, खासकर जब विभिन्न नमूना प्रकारों से निपटते हैं या उच्च-थ्रूपुट क्षमताओं की मांग करते हैं।
समस्या निवारण के लिए सुझाव
संभावित मुद्दों को रोकने के लिए, शुरू में सुनिश्चित करें कि सभी सामग्री आवश्यक गुणवत्ता मानकों का पालन करती हैं और समाप्त नहीं हुई हैं। संभावित रूप से किसी भी बड़े दूषित पदार्थ को हटाने के लिए एक अतिरिक्त निस्पंदन को नियोजित करके भरा हुआ फिल्टर का समस्या निवारण करें जो नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली के माध्यम से कैम्पिलोबैक्टर के पारित होने को प्रतिबंधित कर सकता है। यदि संदूषण मनाया जाता है, तो सत्यापित करें कि बूंदों को फिल्टर के किनारे के बहुत करीब नहीं रखा गया था और छिद्रों के माध्यम से विरोध के रूप में फिल्टर के चारों ओर जाकर अगर तक पहुंचने की अनुमति दी गई थी। यदि संवर्धन के बाद अपर्याप्त वृद्धि होती है, तो सत्यापित करें कि वायुमंडलीय कंटेनरों की सील तंग हैं और लीक नहीं हो रही हैं।
संभावित शोधन और विस्तार
वैकल्पिक फिल्टर सामग्री की खोज माइक्रोबियल ट्रैवर्सल को बढ़ा सकती है और इस प्रोटोकॉल को भोजन जैसे विषम मिश्रण से अन्य प्रेरक सूक्ष्मजीवों को अलग करने में उपयोग के लिए विस्तारित करने में सक्षम कर सकती है। विशिष्टता को नकारात्मक रूप से प्रभावित किए बिना कम गतिशील कैम्पिलोबैक्टर वेरिएंट को बनाए रखने के लिए नियंत्रणों की पहचान करना उचित है। इसके अतिरिक्त, जबकि इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले मल्टीप्लेक्स क्यूपीसीआर परख को C.lari18 का पता लगाने की क्षमताओं का प्रदर्शन किया गया था, ब्याज की अन्य कैम्पिलोबैक्टर प्रजातियों को इस परख के भीतर शामिल किया जा सकता है।
सारांश में, विभिन्न मापदंडों और सेटिंग्स का मूल्यांकन करने के माध्यम से, फिल्टर आधारित अलगाव और सी जेजुनी और सी की प्रजातियों स्तर की पहचान के लिए उपयुक्त शर्तों की स्थापना की गई. भोजन से कोलाई विधि को संवेदनशील, विशिष्ट, मजबूत और लागत प्रभावी होने के लिए प्रदर्शित किया गया है। इसे वास्तविक खाद्य नमूनों पर लागू करके, प्रोटोकॉल 36 सी को अलग करने में सक्षम था।
प्रोटोकॉल एफएसआईएस निर्देश 10,250.117 के साथ संरेखित है, जो कच्चे चिकन भाग के नमूने के लिए प्रक्रिया की रूपरेखा तैयार करता है, और एमएलजी 41.076 कैम्पिलोबैक्टर के अलगाव और पहचान के लिए। डेटा से पता चलता है कि 4x द्वारा नमूना ध्यान केंद्रित और 24 घंटे के लिए यह समृद्ध, निस्पंदन और चढ़ाना के साथ मिलकर, पैदावार अलग, 48 घंटे के भीतर कालोनियों की पुष्टि के रूप में 96 घंटे के विरोध में. प्रोटोकॉल डीएनए-आधारित तरीकों जैसे जीनोम अनुक्रमण के साथ संगत है, जो कैम्पिलोबैक्टर उपभेदों का व्यापक लक्षण वर्णन प्रदान करता है, जिसमें उनके रोगाणुरोधी प्रतिरोध प्रोफाइल, विषाणु भविष्यवाणियां और फ़ाइलोजेनेटिक संबंध शामिल हैं। प्रोटोकॉल कच्चे पोल्ट्री से कैम्पिलोबैक्टर एसपीपी की कुशल वसूली और अलगाव के लिए एक आशाजनक विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है, जो महामारी विज्ञान के अध्ययन और सार्वजनिक स्वास्थ्य हस्तक्षेपों की सुविधा प्रदान कर सकता है।
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को अमेरिकी कृषि विभाग, कृषि अनुसंधान सेवा (यूएसडीए-एआरएस), राष्ट्रीय कार्यक्रम 108, वर्तमान अनुसंधान सूचना प्रणाली संख्या 8072-42000-093 और 8072-42000-094-000-डी द्वारा समर्थित किया गया था। इस लेख में व्यापार नामों या वाणिज्यिक उत्पादों का उल्लेख केवल विशिष्ट जानकारी प्रदान करने के उद्देश्य से है और अमेरिकी कृषि विभाग द्वारा सिफारिश या समर्थन का संकेत नहीं देता है। यूएसडीए एक समान अवसर प्रदाता और नियोक्ता है।
Materials
| Agar – Solidifying Agent (Difco) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 281230 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | JL602-G/L | Equipment |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | AB54-S | Equipment |
| Antibiotic supplements cefoperazone, cycloheximide, trimethoprim, vancomycin | Oxoid Ltd. | SR0183E | |
| Atmosphere Control Gas Pak (Campy, 85% N2, 10% CO2, and 5% O2) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 260680 | |
| Atmosphere Control Vessel, GasPak EZ CampyPak container system | Becton, Dickinson and Company (BD) | 260678 | |
| Autoclave – Amsco Lab250, Laboratory Steam Sterilizer | Steris plc | LV-250 | Equipment |
| Biological Safety Cabinet, Type A2, Purifier Logic+ | Labconco Corporation | 302411101 | Equipment |
| Bolton broth | Oxoid Ltd. | CM0983 | |
| Brucella broth (Difco) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 211088 | |
| Buffered Peptone Water | Bio-Rad Laboratories Inc. | 3564684 | |
| Centrifuge Microcentrifuge 5424 | Eppendorf | 5424 | Equipment |
| Centrifuge, Avanti J-25 | Beckman Coulter, Inc. | Equipment | |
| Chicken thighs, wings, drumsticks, livers | Local retailers | ||
| DNA Extraction – PreMan Ultra Sample Preparation Reagent | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4318930 | |
| FAM probe for hipO (Sequence 5'-TTGCAACCTCACTAGCAAAATCC ACAGCT-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Filter – 0.45 µm sterile cellulose acetate filter | Merck-Millipore LTD | DAWP04700 | |
| Filter – 0.65 µm sterile cellulose acetate filter | Merck-Millipore LTD | HAWG04700 | |
| forward primer for cdtA (Sequence 5'-TGTCAAACAAAAAACACCAAGCT T-3' ') |
Integrated DNA Technologies | ||
| forward primer for hipO (Sequence 5'-TCCAAAATCCTCACTTGCCATT-3') | Integrated DNA Technologies | ||
| forward primer for IAC (Sequence 5'-GGCGCGCCTAACACATCT-3') | Integrated DNA Technologies | ||
| HEX probe for cdtA (Sequence 5'-AAAATTTCCCGCCATACCACTTG TCCC-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Incubator – Inova 4230 refrigerated incubator shaker | New Brunswick Scientific | 4230 | Equipment |
| Inoculating Loop – Combi Loop 10µL and 1µL | Fisher Scientific International, Inc | 22-363-602 | |
| Internal Amplification Control (IAC) DNA fragment (Sequence 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTAT GTGGTGGCATTGTCTTCTCCC GTTGTAACTATCCACTGAGATG TGTTAGGCGCGCC-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Laked horse blood | Remel Inc. | R54072 | |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | Mettler Toledo | 17014382 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ | Mettler Toledo | 17014384 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ | Mettler Toledo | 17014388 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | Mettler Toledo | 17014391 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | Mettler Toledo | 17014392 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ | Mettler Toledo | 17013805 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-20XLS+ | Mettler Toledo | 17013803 | Equipment |
| Media Storage Bottle -PYREX 1 L Square Glass Bottle, with GL45 Screw Cap | Corning Inc. | 1396-1L | Equipment |
| Media Storage Bottle -PYREX 2 L Round Wide Mouth Bottle, with GLS80 Screw Cap | Corning Inc. | 1397-2L | Equipment |
| Microtiter plate, 96 well plate, flat bottom, polystyrene, 0.34 cm2, sterile, 108/cs | MilliporeSigma | Z707902 | |
| Mixer – Vortex Genie 2 | Scientific Industries Inc. | SI-0236 | Equipment |
| Motorized pipette controller, PIPETBOY2 | INTEGRA Biosciences Corp. | Equipment | |
| PCR Mastermix 2× TaqMan Gene Expression | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4369542 | |
| Petri Dish Rotator - bioWORLD Inoculation Turntable | Fisher Scientific International, Inc | 3489E20 | Equipment |
| Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15mm) | Fisher Scientific International, Inc | FB0875713 | |
| Pipette Tips GP LTS 1000µL S 768A/8 | Mettler Toledo | 30389273 | |
| Pipette Tips GP LTS 20µL 960A/10 | Mettler Toledo | 30389270 | |
| Pipette Tips GP LTS 200µL F 960A/10 | Mettler Toledo | 30389276 | |
| Reagent Reservoir, 25 mL sterile reservoir used with multichannel pipettors | Thermo Fisher Scientific Inc. | 8093-11 | |
| Realtime PCR – 7500 Real-Time PCR system | (Applied Biosystems, Foster City, CA) | Equipment | |
| reverse primer for cdtA (Sequence 5'-CCTTTGACGGCATTATCTCCTT-3') | Integrated DNA Technologies | ||
| reverse primer for hipO (Sequence 5'-TGCACCAGTGACTATGAATAACG A-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| reverse primer for IAC (Sequence 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTA -3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (10 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170356N | |
| Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (2 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170372N | |
| Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (25 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170357N | |
| Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (50 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170376N | |
| Spreader – Fisherbrand L-Shaped Cell Spreaders | Fisher Scientific International, Inc | 14-665-230 | |
| Stomacher bag, Nasco Whirl-Pak Write-On Homogenizer Blender Filter Bags | Thermo Fisher Scientific Inc. | 01-812 | |
| TAMRA probe for IAC (Sequence 5'-TTACAACGGGAGAAGACAATGCC ACCA-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Thermocycler (GeneAmp PCR system 9700) | Applied Biosystems | Equipment | |
| Water Filtration – Elga Veolia Purelab Flex | Elga LabWater | PF2XXXXM1-US | Equipment |
Riferimenti
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